冷杉梢斑螟对红松球果挥发物的触角电位及行为反应

邵凌松，王雅静，陈焕文，解丹，宇佳

(1.烟台市森林资源监测保护服务中心，山东 烟台 265199；2.东北林业大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

冷杉梢斑螟(Dioryctriaabietella)是一种球果钻蛀类害虫，属鳞翅目(Lepidopetera)螟蛾科(Pyralidae)梢斑螟属(Dioryctria)，主要危害球果的基部和中部[1]。近年来，我国东北地区红松(Pinuskoraiensis)受冷杉梢斑螟的影响，导致红松种子严重减产。由于冷杉梢斑螟整个幼虫期均在球果内取食发育，隐蔽性较强[2]，防治难度大、成本高，给林业生产带来了较大的压力。

红松主要产于我国东北地区，红松籽含油量很高，具备较高的工业、药用和食用价值，具有极高的开发潜力[3]。在种子成熟的过程中，冷杉梢斑螟对其的危害几乎是毁灭性的，受其危害的球果一般可造成大半果实空壳化，严重的可致球果畸形、颗粒无收。

昆虫对寄主植物的气味高度敏感，能够识别来自寄主植物的多种挥发性气味，并进行精准定位，完成交配产卵等活动[4-8]。利用植物源诱芯对鳞翅目昆虫的诱集和防治是一种十分有效的手段[9]。本研究基于昆虫与寄主植物气味的选择机理进行冷杉梢斑螟对寄主不同气味的感受规律研究，以期为冷杉梢斑螟植物源诱芯的研发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试昆虫 冷杉梢斑螟被害球果采自黑龙江省勃利县红旗林场。将带有冷杉梢斑螟幼虫的红松球果带回实验室，用40目的纱网将红松球果罩住，于室内阴凉通风处放置。每3 d观察一次，收集从球果中出来的冷杉梢斑螟幼虫所化的蛹，放于小养虫盒中。养虫盒中放入沾有少量无菌水的脱脂棉球，待成虫羽化后立即将雌雄分开放置待用。

1.1.2 供试球果的采集 用于采集气味的球果于2020年7月中旬采集，用于收集蛹的球果于2020年8月下旬采集。

1.1.3 供试药剂 选择红松球果中较为常见的6种挥发物(表1)进行触角电位和行为学试验。使用液体石蜡将挥发物标准品稀释为1、1.0×10-1、1.0×10-2、1.0×10-3、1.0×10-4和1.0×10-5molL-16个浓度梯度的供试溶液，并以液体石蜡为对照进行试验。

表1 供试药剂

1.2 方法

1.2.1 红松球果挥发物的收集和成分分析 将红松球果连同部分枝条采下，并用封口膜将伤口包裹。将球果放进聚四氟乙烯密封袋内，枝条放在密封袋外，密封袋和枝条间用脱脂棉填充后用铁丝在密封袋外将其勒紧，以保证收集装置的气密性。试验开始时，打开密封袋的气阀，用抽气泵将密封袋内的空气抽出，再用大气采样仪连接洗气瓶将纯净的空气充满密封袋，关紧气阀，20 min后将密封袋内的空气抽进苏马罐，将苏马罐带回实验室上机分析。

采用GC17A/5973N(MS)气质联用仪测定红松球果挥发物成分，其中，色谱柱选用DB-5石英毛细管柱(30.00 m×0.25 mm，0.25 μm)，载气选用高纯度氮气。柱前压为72.6 kPa，进样口的温度为150 ℃，采用分流进样，柱流速设置为1.33 mLmin-1，进样量为0.2 μL。初始温度为40 ℃，并以5 ℃min-1的速率升温，升到90 ℃，再以8 ℃min-1的速率升温，升到250 ℃后，保持该温度2 min。MS条件，EI电离，电子能量70 eV，离子源温度230 ℃，扫描范围(m/z)50～500 amu，扫描时间0.14 s。采用Xcalibur软件，对比查询NIST98.L谱库，结合色谱保留时间进行成分鉴定。通过面积归一法计算每种挥发物的相对含量。

1.2.2 触角电位测定 取活跃的冷杉梢斑螟成虫，用解剖刀将头部切下，用导电胶将2根金属电极与触角两端相连，而后将连有触角的电极与触角电位仪相连。为了减小试验过程中因触角失活造成的误差，每隔0.5 h换用新的触角，来保证昆虫触角的活性。在巴斯德管中放置一片干净的滤纸片，通过移液器将待测溶液滴至滤纸片上，固定金属电极以及送气管，以确保挥发物在巴斯德管中被均匀地运送至触角，通气流量为300 mLmin-1。开始测定时，每次在滤纸上滴10 μL样品溶液，每种样品每个浓度各重复测定5次，同一试剂的刺激顺序按低浓度到高浓度进行，同时取稀释挥发物溶液所用的液体石蜡为对照进行对比试验，将前后2次处理测定值的平均值减去对照组所得数值即为EAG(mV)相对反应值。

1.2.3 行为学测定 利用Y型嗅觉仪开展进一步的试验，测定冷杉梢斑螟成虫对不同挥发物的选择行为。在试验开始前，用移液枪分别将20 μL样品和对照组溶液滴在2 cm×2 cm的滤纸片上，并将滤纸片放入气味源放置瓶。控制气流，通气15 s后将试虫放在引虫口处将成虫引入Y型管中，观察成虫在5 min内的反应，若进入样品一侧的臂，并在内移动超过2.5 cm，说明该化合物对其有引诱作用；若进入对照组一侧的臂，并在内移动超过2.5 cm，说明该化合物对其有驱避作用。否则即为无反应。每次测试后要更换清洗后的样品臂和对照臂，每只供试昆虫只使用1次，不可多次使用。

1.2.4 数据处理 试验所得的EAG相对反应值多重比较采用Duncan检验；对嗅觉行为反应的结果进行卡方检验。数据分析均使用 IBM SPSS Statistics 26软件。

2 结果与分析

2.1 红松球果主要挥发物成分及相对含量分析

通过在林间对红松球果挥发物的收集与分析，共鉴定出15种化合物(表2)。其中，萜烯类物质种类最丰富，有13种；烷烃类物质相对较少，只有2种。其中(+)-α-蒎烯相对含量最高，为40.50%，其次为月桂烯和β-蒎烯，相对含量分别为13.69%和11.57%。

表2 红松球果主要挥发物相对含量

2.2 冷杉梢斑螟对红松球果主要挥发物的EAG反应

冷杉梢斑螟对红松球果6种主要挥发物及其不同浓度的相对EAG反应值如表3所示。

表3 冷杉梢斑螟成虫对6种挥发物的EAG反应

2.3 行为学反应

依据EAG值测定结果，选出了具有明确EAG反应的各种浓度挥发物，开展进一步的行为反应测定(表4)。结果表明： (+)-α-蒎烯除1.0×10-1molL-1浓度外其他浓度对雌虫均显著吸引(P<0.05)，在1.0×10-1molL-1、1.0×10-2molL-1和1 molL-1下对雄虫显著吸引(P<0.05)；α-蒎烯在1.0×10-3molL-1到1 molL-14个浓度梯度下均对雌虫显著吸引，对雄虫在各个浓度下均不表现出选择差异(P<0.05)；(-)-β-蒎烯在1.0×10-3molL-1和1.0×10-2molL-1浓度下对雌虫显著驱避，在1.0×10-1molL-1和1 molL-1浓度下对雄虫显著吸引(P<0.05)；β-蒎烯在1.0×10-2molL-1、1.0×10-1molL-1和1 molL-1浓度下对雌虫显著吸引，在1.0×10-2molL-1浓度下对雄虫显著吸引(P<0.05)；月桂烯1.0×10-4molL-1到1 molL-15个浓度梯度下均对雌虫显著吸引，在1.0×10-2molL-1到1 molL-13个浓度梯度下均对雄虫显著吸引(P<0.05)；3-蒈烯在1.0×10-3molL-1到1 molL-14个浓度梯度下均对雌虫显著吸引，1.0×10-4molL-1到1 molL-15个浓度梯度下均对雄虫显著吸引(P<0.05)。

表4 冷杉梢斑螟成虫对6种挥发物行为学卡方检验结果

总体看，(+)-α-蒎烯、α-蒎烯、β-蒎烯、月桂烯和3-蒈烯5种挥发物对冷杉梢斑螟雌虫有吸引作用，(-)-β-蒎烯对冷杉梢斑螟雌虫有驱避作用。(+)-α-蒎烯、(-)-β-蒎烯、β-蒎烯、月桂烯和3-蒈烯5种挥发物对冷杉梢斑螟雄虫有吸引作用。

3 结论与讨论

植物和昆虫千百万年来协同进化，昆虫已经进化出来一套完整的系统，寻找适合的场所进行交配和产卵[10]。植物同样会散发一些气味来吸引天敌前来[11]。植物挥发出的分子量较低的小分子化合物会和昆虫触角感器上的受体相结合，从而将气味以电信号的形式传送，以此调控昆虫的行为[12]。在整个昆虫寻找寄主的过程中不单单是一种气味起作用，而是由植物所散发出来的各种挥发性化合物组成的气味网络共同起作用。挥发性化合物不一定对昆虫都有吸引作用，也有一些物质对它们有驱避作用[13]。通过对冷杉梢斑螟在东北地区主要寄主——红松球果的挥发物分析，共鉴定出15种化合物。其中，共有13种萜烯类物质和2种烷烃类物质，均为较常见的红松挥发物。这些挥发物均不是红松球果所特有的，在红松枝条和主干上也比较常见[14-17]。所以，冷杉梢斑螟在选择寄主时，关键的因素可能是某种物质单位时间的释放量及不同挥发物之间的配比[18]。如红松主干的(+)-α-蒎烯相对含量和本试验测得的红松球果中的相对含量十分接近，但总物质种数及其他物质的相对含量相差较大[19,20]。

试验研究发现，所选的6种化合物均能在较高浓度条件下引起冷杉梢斑螟雌雄成虫的EAG反应，但对同种物质的不同浓度感受差异较大。α-蒎烯、(-)-β-蒎烯及月桂烯引发雄虫EAG反应的起始浓度较大，β-蒎烯引发雌虫EAG的起始浓度较大，这可能与冷杉梢斑螟雌雄成虫在寻找寄主过程中所担任的角色及雌雄成虫触角感受气味的感器组成有关，对雌雄成虫来说，它们感受寄主挥发物的浓度也有较大差异，这极可能和它们的求偶和产卵行为存在一定的关联[21]。因为雌虫要为下一代选择适宜的寄主，而雄虫在寻找寄主的同时，更多的是要寻找雌虫。进一步Y型嗅觉仪行为学试验发现，(+)-α-蒎烯、β-蒎烯、月桂烯和3-蒈烯对冷杉梢斑螟雌雄成虫均有吸引能力，α-蒎烯只对雌虫表现出吸引能力，(-)-β-蒎烯对雌虫表现为驱避，对雄虫表现为吸引；红松球果中即存在对冷杉梢斑螟成虫有吸引作用的物质，也存在驱避作用的物质，这或许也是植物的一种防御手段。在复杂的气味网络系统中，冷杉梢斑螟是怎么定位寄主的还需要后续进行大量的研究工作进行验证。