2，4-二叔丁基苯酚对细叶小羽藓生理的影响

宋春燕，王 琪，单壹壹，李丹丹，于 晶

（上海师范大学生命科学学院，上海 200234）

0 引言

苔藓植物是一类独特的高等植物类群，其形态结构矮小，有茎和叶的分化，茎叶一般由单层或少数几层细胞构成，体表无蜡质的角质层，或角质层不发达，无维管束组成的输导组织，无真正的根，其根称之为“假根”，仅具有吸附作用［1］.苔藓植物营养物质来自茎叶体表吸收，对环境变化特别敏感，独特的生物学特性使其被广泛应用于环境质量的生物指示和监测［2］.苔藓植物具有涵养水源、保持水土、循环与贮存营养物质、森林更新、重建与恢复植被等生态功能，是生态系统中必不可少的一类群体［3］.细叶小羽藓（Haplocladium microphyllum（Sw.ex Hedw.）Broth.）为羽藓科（Thuidiaceae）小羽藓属（Haplocladium）的一种苔藓植物，色泽鲜绿，植株纤细，生长交织错落有致，不仅具有较高的生态价值，还具有清热解毒、消炎等药用价值.随着城市化快速发展，部分地区干旱化程度不断加深，而细叶小羽藓既可丰富城市园林植物种类，还可维持植物群落的生态平衡，再现丰富多样的自然景观［4-6］.本文作者在野外工作时，观察发现我国东南沿海地区木麻黄林地鲜有苔藓植物的分布，目前不清楚木麻黄林地化感物质对苔藓植物的生长发育是否有影响.

木麻黄是我国东南沿海防护林主要树种，在东南海岸已有70多年的栽培历史，其主要作用在于防风固沙、改良土壤和改善海岸带生态环境等［7］.但由于木麻黄防护林树种单一，群落结构简单，木麻黄所产生的化感物质可以通过自然挥发、雨雾淋溶、根系分泌、植物残体分解等途径聚积在土壤中，这些有毒物质不断积累，不仅抑制自身林下幼苗生长，而且对其他植物产生化感作用［8］.YAO等［9］在木麻黄的凋落物、土壤、根中均检测出2，4-二叔丁基苯酚（2，4-DTBP）等酚酸类物质，且2，4-DTBP的相对含量最高.2，4-DTBP是一种黄白色结晶固体，不溶于水，至少来源于169种生物［10］，如细菌［11-12］、真菌［13］、高等植物［14-15］等的天然化合物，具有抗氧活性［16］、抗菌杀虫活性［17-18］、抗炎活性［19］、植物化感效应［20］和除草效应［15］等性质.QIN等［21］研究发现2，4-DTBP对莴苣（Lactuca sativaL.）、水稻（Oryza sativaL.）以及稗草（Echinochloa crus-galliL.）的种子萌发和幼苗生长化感抑制活性相对最强.ZHANG等［22］在不同植龄啤酒花（Humulus lupulusL.）根系分泌物及根际土壤中检测出2，4-DTBP的相对含量最高，实验结果表明，适宜低浓度的2，4-DTBP对啤酒花生长和光合特性具有促进作用，而高浓度的2，4-DTBP能对啤酒花的生长产生化感抑制效应.XUAN等［23］从茅草（Imperata cylindrica（L.）Beauv.）的根茎和根系分泌物中提取出的2，4-DTBP对杂草萌发和幼苗生长具有化感抑制作用.GAO等［24］探究内蒙古荒漠草原优势植物根分泌物2，4-DTBP对根际微生物的影响时，发现当2，4-DTBP质量浓度高于7.5 g·μL-1时，会对部分细菌生长有抑制效应，土壤细菌物种多样性明显降低.

木麻黄林地中化感物质2，4-DTBP相对含量最高，因此，本研究通过施加不同浓度的2，4-DTBP处理细叶小羽藓，研究2，4-DTBP对细叶小羽藓叶绿素、脯氨酸、丙二醛含量的影响，揭示2，4-DTBP对苔藓植物的化感作用，为探究细叶小羽藓是否适应木麻黄林地生态环境提供参考.

1 材料与方法

1.1 实验材料

于2020年12月11日在康健园、桂林公园、上海师范大学徐汇校区、奉贤校区采集适量细叶小羽藓，用蒸馏水洗净泥土，去除杂质.以吸水性纱布作为基质，将纱布高温灭菌后，浸没于蒸馏水中，使纱布吸满水，然后将纱布平铺在广口浅盆中.把已经洗净的细叶小羽藓植物体均匀地种植于纱布表面上，放入光照恒温培养箱里培养，设定光照12 h/黑暗12 h，温度22℃，每2 d喷洒蒸馏水50 mL［25］.将其驯化至植物体生长良好状态，周期为1周.

1.2 实验方法

1.2.1 培养方法

选取驯化后生长一致的植株继续培养.选择木麻黄分泌物中的化感物质2，4-DTBP，采用化学分析纯（购买自国药集团）作为外源模拟生化试剂.每7 d喷洒一次物质的量浓度分别为0（CK），0.01，0.05，0.10，0.50，1.00 mmol·L-1的2，4-DTBP试剂，每次喷洒50 mL，每周测量一次光合色素、脯氨酸和丙二醛的含量，做3次平行实验，实验周期为8周.

1.2.2 测量方法

光合色素的提取测量采用BAO等［26］的方法.比色测定色素，以95%（体积分数）乙醇为空白对照，在665和649 nm波长下测定吸光度，计算叶绿素a、叶绿素b含量，参照WANG［27］方法，采用酸性茚三酮法测量脯氨酸含量，采用硫代巴比妥酸（TBA）法测量丙二醛含量.

1.3 数据处理方法

实验数据使用Microsoft Excel 2019软件进行统计分析，运用SPSS进行显著性差异分析，并用Origin 2019进行制图.

2 结果与分析

2.1 2,4-DTBP对细叶小羽藓叶绿素含量的影响

2，4-DTBP对细叶小羽藓叶绿素a含量存在“低促高抑”的现象，如图1所示.

当2，4-DTBP物质的量浓度在0～0.05 mmol·L-1时，细叶小羽藓的叶绿素a含量明显高于对照组，差异达到显著性水平（P＜0.05），且随着2，4-DTBP浓度增加，叶绿素a含量逐渐增加.当2，4-DTBP物质的量浓度为0.05～0.10 mmol·L-1时，叶绿素a含量出现最高值，比对照组增加9.75%～62.46%.但当2，4-DTBP物质的量浓度增加至0.50 mmol·L-1时，叶绿素a含量略低于或约等于对照组.当2，4-DTBP物质的量浓度增加至1 mmol·L-1时，叶绿素a含量低于对照组，差异达到显著性水平（P＜0.05），比对照组降低0.04%～24.00%.随着实验周期的增加，叶绿素a的含量逐渐减少，且低于对照组，除第二周外.2，4-DTBP物质的量浓度为0～0.1 mmol·L-1时，叶绿素a+b含量高于对照组，差异达到显著性水平（P＜0.05），且随着2，4-DTBP浓度增加，叶绿素a+b含量逐渐增加.当2，4-DTBP物质的量浓度大于0.50 mmol·L-1时，叶绿素a+b含量相比于对照组无显著差异，如图2所示.

图2 不同浓度2，4-DTBP处理下细叶小羽藓中叶绿素a+b含量随处理时间的变化

由图1，2可知，适宜物质的量浓度（0～0.10 mmol·L-1）的2，4-DTBP能够使得细叶小羽藓的叶绿素含量增加；而2，4-DTBP物质的量浓度大于0.50 mmol·L-1时，细叶小羽藓的叶绿素含量下降.

图1 不同浓度2，4-DTBP处理下细叶小羽藓中叶绿素a含量随处理时间的变化.同一行中的不同的小写字母表示0.05水平差异显著性，下同.

2.2 2,4-DTBP对细叶小羽藓脯氨酸含量的影响

如图3所示，当2，4-DTBP物质的量浓度在0～0.05 mmol·L-1时，脯氨酸含量低于对照组，差异达到显著性水平（P＜0.05），且随着2，4-DTBP浓度的增大，脯氨酸含量逐渐降低.在2，4-DTBP物质的量浓度为0.05 mmol·L-1时，脯氨酸含量达到最低值，差异达到显著性水平（P＜0.05），比对照组降低0.58%～2.88%；2，4-DTBP物质的量浓度增加至0.50 mmol·L-1时，脯氨酸含量略高于对照组.当2，4-DTBP物质的量浓度增加至1.00 mmol·L-1时，脯氨酸含量高于对照组的趋势更加明显，差异达到显著性水平（P＜0.05），比对照组高2.11%～3.09%.结果表明，用低浓度2，4-DTBP处理时，细叶小羽藓脯氨酸含量降低，而较高浓度的2，4-DTBP使得细叶小羽藓脯氨酸含量提高.

图3 不同浓度2，4-DTBP处理下细叶小羽藓中脯氨酸含量随处理时间的变化

2.3 2,4-DTBP对细叶小羽藓丙二醛含量的影响

如图4所示，当2，4-DTBP物质的量浓度在0～0.10 mmol·L-1时，丙二醛含量低于对照组，差异达到显 著 性 水 平（P＜0.05），且 随 着2，4-DTBP浓 度 的 增 大，丙 二 醛 含 量 逐 渐 降 低.当2，4-DTBP物质的量浓度为0.10 mmol·L-1时，丙二醛含量出现最低值，差异达到显著性水平（P＜0.05），比对照组降低7.20%～23.01%，但当2，4-DTBP物质的量浓度大于0.50 mmol·L-1时，丙二醛含量开始逐渐回升.当2，4-DTBP物质的量浓度增加至1.00 mmol·L-1时，丙二醛含量趋近于对照组，差值在-4.18%～0.73%波动.结果表明，用低浓度2，4-DTBP处理时，细叶小羽藓丙二醛含量降低，而高浓度2，4-DTBP使得细叶小羽藓丙二醛含量提高.

图4 不同浓度2，4-DTBP处理下细叶小羽藓中丙二醛含量随处理时间的变化

3 结论与讨论

植物光合作用具有制造有机物，实现太阳能的转化与储存，为地球上的生物提供直接或间接的能源，稳定大气中的氧和二氧化碳的含量等重要意义［28］.叶绿素是光合作用必不可少的色素，是吸收光能的物质基础，是光合作用的光敏催化剂，直接影响光合作用的强弱，其含量是植物适应环境生长发育的重要指标［29］.ZHANG等［22］的研究结果表明，低浓度的2，4-DTBP对啤酒花幼苗光合作用有一定促进作用，而高浓度的2，4-DTBP抑制光合作用强度.本研究也得出相似结论，低物质的量浓度（＜0.10 mmol·L-1）的2，4-DTBP能促进细叶小羽藓叶绿素的合成，高物质的量浓度（＞0.50 mmol·L-1）的2，4-DTBP能促使叶绿素降解.

脯氨酸在植物体内是一种渗透调节物质，逆境条件下，植物体内脯氨酸含量会有明显的积累，有利于减轻逆境对植物的伤害，同时在一定程度上反映了植物的抗逆性［30］.LI等［31］研究4种苔藓植物对不同水族箱水体条件的生理响应，发现随着水淹时间的延长，植物叶中脯氨酸积累，调节逆境环境条件下的适应能力.本研究得出如下结论：在2，4-DTBP物质的量浓度低于0.10 mmol·L-1的环境里，细叶小羽藓的脯氨酸含量增加不明显，当2，4-DTBP物质的量浓度高于0.50 mmol·L-1时，细叶小羽藓的脯氨酸含量增加明显.细叶小羽藓能适应低浓度的2，4-DTBP环境，在高浓度的2，4-DTBP环境里则产生大量脯氨酸以减轻逆境对其生长的伤害，并反映了高浓度的2，4-DTBP对苔藓植物的生理活动有一定影响.

活性氧的产生和相关的氧化应激被认为是植物感化效应的主要作用机制［32］.2，4-DTBP能通过活性氧的生成诱导氧化应激，引起根系组织和叶片组织中叶绿体的脂质过氧化和膜损伤［15］.丙二醛是植物细胞质膜过氧化的最终产物，其含量的多少显示了植物细胞质膜过氧化的程度，可作为检测逆境条件下膜系统受损程度的指标［33］.HALIM［34］等研究了2，4-DTBP对杂草植物叶片叶绿体超微结构和叶片生理的影响，研究结果表明，叶绿体的超微结构损伤明显，类囊体系统紊乱，膜呈波动状，淀粉粒缺乏，质体球蛋白增多，叶片绿度、量子产量和气孔导度值降低.ZHOU等［35］探究不同浓度2，4-DTBP对番茄叶霉菌及番茄种子萌发幼苗生长的影响，得出低浓度2，4-DTBP处理能使番茄叶片中丙二醛含量下降，降低膜脂过氧化程度，但处理浓度过大时，将影响植物自我调节能力，膜脂过氧化作用增强.这与本研究结果一致，低浓度（＜0.10 mmol·L-1）的2，4-DTBP能够降低细叶小羽藓的丙二醛含量，而高浓度（＞0.50 mmol·L-1）的2，4-DTBP能够提高细叶小羽藓的丙二醛含量.使用低浓度的2，4-DTBP处理苔藓植物，并未使其体内活性氧增多，所以丙二醛含量不高.而高浓度的2，4-DTBP使苔藓植物体内活性氧大量积累，促进膜脂过氧化作用增强，使膜结构遭到破坏，丙二醛含量升高.

综上所述，低浓度的2，4-DTBP对细叶小羽藓生长具有促进作用，但高浓度的2，4-DTBP对细叶小羽藓生长具有抑制作用.我国东南沿海木麻黄林地的化感物质2，4-DTBP大量累积，其浓度已高于适宜细叶小羽藓生长发育的最适浓度，对细叶小羽藓生长繁殖有一定抑制效应.

本研究仅以木麻黄林地化感物质中含量最为丰富的2，4-DTBP溶液对细叶小羽藓生理反应进行室内实验，尚未能在木麻黄林地开展野外实验.且实验只以细叶小羽藓为研究对象，苔藓植物丰富多种，如毛尖紫萼藓（Grimmia piliferaP.Beauv.）［36］、山墙藓（Tortula ruralis（Hedw.）G.Gaertn.，B.Mey.&Scherb.）［37］等耐旱苔藓植物，具有胁迫耐受性，因此，还需对更多种苔藓植物进行化学物质胁迫实验研究，为苔藓植物是否能适应木麻黄林地生态环境提供参考.