驱动蛋白家族成员23对结直肠癌细胞增殖、迁移的影响及其作用机制

黄瑜 周先果 李学宇 韦柳婷 曹骥 容敏华

作者单位：530021 南宁 广西医科大学附属肿瘤医院实验研究部

结直肠癌是世界上第三大常见的恶性肿瘤，也是癌症相关死亡的第二大原因，每年新增确诊病例约190万例[1]。近年来针对结直肠癌筛查、诊断及预后管理方面的研究不断深入[2]，但我国结直肠癌发病率和死亡率仍在持续上升[3-4]。因此，亟需挖掘新的靶基因并开发新的靶向药物，以提高结直肠癌患者的生存和生活质量。驱动蛋白家族成员23（kinesin family member 23，KIF23）是驱动蛋白家族的成员之一，作为一种关键的运动蛋白，其在有丝分裂、纤毛发生和微管运动等多种细胞过程中发挥重要作用，在多种肿瘤中也发现其表达上调而促进肿瘤发生、发展[5-6]。然而KIF23在结直肠癌中确切的作用及其机制尚未完全清楚。MDM2-p53是熟知的蛋白与蛋白相互作用，也是细胞凋亡的重要调控通路[7]。p53能修复DNA损伤，维持基因组稳定，调节细胞周期和避免细胞癌变。p53基因功能失调或蛋白稳定性和活性发生改变均可能导致肿瘤的发生[8]。MDM2是p53重要的内在抑制因子，通过泛素化等途径对p53进行降解[9]。有研究报道过表达的MDM2会影响p53的激活，导致DNA损伤积累和细胞突变，在癌细胞增殖、迁移、侵袭和血管生成中起重要作用[10]。p21作为p53下游的细胞周期依赖性激酶抑制剂（CDKI）的家族重要成员，能调节细胞周期、DNA复制和修复，是激活的p53的主要转录靶点[11]。目前MDM2-p53/p21轴已被发现在多种恶性肿瘤中起重要作用[12-13]，但在结直肠癌中的作用尚未完全阐明。本研究通过分析KIF23在结直肠癌中的表达及其与临床病理参数的相关性，并探讨KIF23是否通过MDM2-p53/p21轴影响结直肠癌细胞生物学行为，为阐明结直肠癌的发生发展机制以及寻找新的早期诊断和靶向治疗新靶点提供依据。

1 材料与方法

1.1 临床资料

收集2021年5月至2021年12月在广西医科大学附属肿瘤医院诊治的结直肠癌患者的临床资料，获取相应患者癌组织及其癌旁正常组织标本。纳入标准：⑴经组织病理学确诊为结直肠癌；⑵术前均未行放疗、化疗等抗肿瘤治疗。排除标准：合并其他恶性肿瘤、感染性疾病、自身免疫疾病等以及资料不完整患者。基于以上标准共纳入20例结直肠癌患者，同时收集患者性别、年龄、肿瘤大小、分化程度等临床资料。本研究经广西医科大学附属肿瘤医院伦理委员会审查批准，患者均知情同意。

1.2 主要材料与试剂

人结肠癌细胞系RKO细胞（CL-0196）购自中国普诺赛公司；MEM培养基（11095080）、胎牛血清（10099141）、青链霉素（15140122）购自美国Gibco公司；Trizol试剂（15596018）购自美国 Invitrogen Carlsbad公司；逆转录试剂盒PrimeScript®RT reagent Kit（RR047A）、RT-qPCR检测试剂（RR820A）均购自日本TaKaRa公司；转染试剂StemfectTMRNA Transfection Kit（00-0069）购自美国Stemfect公司；RIPA裂解液（P0013B）购自中国碧云天公司；PVDF膜（IPFL00010）购自美国 Millipore公司；抗体 GADPH（ab9485）、KIF23（ab174304）、MDM2（ab259265）、p53（ab32389）、p21（ab109520）、兔二抗（ab205718）均购自美国Abcam公司；化学发光试剂（34580）购自美国Thermo公司；CCK-8试剂盒（ck04-100）购自日本Dojido公司；EdU试剂盒（C10310-1）购自中国瑞博生物公司；Transwell小室（CLS3412）购自美国Corning公司。

1.3 RT-qPCR检测KIF23的相对表达量

按照Trizol试剂说明书，提取组织、细胞中的总RNA，使用Thermo超微量紫外分光光度计检测RNA纯度，将浓度≥1 000 ng/μL且OD（260 nm）/OD（280 nm）比值位于1.80～2.00之间的合格RNA用于下一步实验。将所得RNA使用逆转录试剂盒Prime-Script®RT reagent Kit逆转录成cDNA保存备用。RT-qPCR检测按试剂盒说明书进行，反应体系：20 μL；反应条件：预变性 95℃ 30 s，变性95℃ 5 s，退火60℃30 s，40个循环，每个样品重复3次。利用NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）设计特异性的引物。KIF23上游引物为GGTCCAGTTGGAAATGAACCAT，下游引物为AGCCTTGGAAGTGTCTGCTC。选用的内参为β-actin，β-actin上游引物为CCTGGCACCCAGCACAAT，下游引物为GGGCCGGACTCGTCATAC。采用2-ΔΔCt法计算各样本KIF23的相对表达量。

1.4 在线数据库分析

本研究中的结直肠癌微阵列数据来自癌症基因组图谱（TCGA）数据库（https：//portal.gdc.cancer.gov/）COADREAD（结直肠癌）项目中的RNA-seq数据。常见结直肠细胞系中KIF23表达量数据来自CCLE数据库（http://sites.broadinstitute.org/ccle）。使用R（4.1.0版本）软件对437例CRC患者的KIF23表达数据的数据集进行整理及可视化处理。

1.5 细胞培养及转染

人结肠癌细胞系RKO细胞培养于添加有10%胎牛血清和1%青链霉素的MEM培养基中。由中国南宁捷尼斯生物科技有限公司合成针对KIF23（siKIF23#1：5'-GACUAUAUCUAGAUCAUGUCU-3'；siKIF23#2：5'-GGUAGAUCUUGCUGGAAGU-3'）和阴性对照NC（siNC：5'-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3'）的小干扰 RNA（siRNAs）。将细胞接种在6孔培养板中，直到细胞汇合度达70%，然后根据制造商说明，使用StemfectTMRNA Transfection Kit将最终浓度为20 mol/L的siRNAs转染至细胞中。根据siRNAs类型将转染的细胞分为siKIF23#1组、siKIF23#2组、siNC组。分别用RT-qPCR和Western blot分析法检测KIF23的表达水平并计算其敲除效率。

1.6 Western blot检测KIF23、MDM2、p53和p21蛋白表达水平

使用RIPA裂解液提取各组细胞中的总蛋白，进行10%SDS-PAGE凝胶电泳，并转移至PVDF膜上，转膜后室温封闭2 h。分别加入内参GADPH，目的抗体KIF23 及 MDM2、p53、p21（稀释比例均为 1∶1 000），4℃孵育过夜；次日洗膜后加入相应兔二抗，室温下孵育2 h。使用化学发光试剂在放射自显影胶片上检测蛋白表达水平。

1.7 CCK-8检测RKO细胞增殖能力

用CCK-8试剂盒进行细胞增殖实验。将RKO细胞按2 000/孔的密度接种在96孔培养板中，每组设3个以上复孔。分别于24 h、48 h、72 h时，向每孔加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃下继续培养2 h，用酶标仪测定450 nm波长处的光密度（OD）值。实验重复3次。

1.8 EDU实验检测RKO细胞增殖能力

用EdU试剂盒检测细胞增殖情况。将各组RKO细胞按2 000/孔的密度接种在96孔培养板中，于细胞汇合度为70%～80%时加入用培养基按1 000∶1的比例稀释后的EdU溶液，37℃放置过夜；按试剂盒说明书进行EdU标记、细胞固定化、Apollo染色、Hoechst染料进行DNA染色后，用荧光显微镜观察并拍照。实验重复3次。

1.9 Transwell小室实验检测RKO细胞迁移能力

使用Transwell小室在24孔板中检测细胞迁移。RKO细胞用无血清培养液稀释，按8×104/孔的密度接种在小室内，下室加含10%胎牛血清的培养液。常规细胞培养条件下静置48 h后，用棉签轻轻擦去上室细胞，用4%多聚甲醛和0.1%结晶紫固定细胞，染色。在显微镜下观察，随机选择3个视野拍照。实验重复3次。

1.10 统计学方法

采用Excel、SPSS 22.0和GraphPad Prism 9.0进行数据处理及分析。正态分布数据中，两组均数比较采用独立样本t检验，多组均数间比较采用单因素方差分析，如果组间差异有统计学意义，进一步采用Dunnett法进行多重比较。计量资料以均数±标准差表示。非正态分布数据采用非参数Wilcoxon秩和检验法分析。采用Fisher检验分析KIF23表达量与临床特征关系之间的关系。以双侧P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 KIF23在结直肠癌中的表达及其与临床病理特征的关系

RT-qPCR检测结果显示，结直肠癌组织中KIF23 mRNA的表达水平高于对应的癌旁正常组织（P＜0.0001，图1A）。TCGA队列数据集分析结果显示，KIF23在结直肠癌组织中的表达水平显著高于正常结直肠组织（P＜0.0001，图1B）。利用CCLE数据库（https：//sites.broadinstitute.org/ccle）比较常见结直肠癌细胞系中KIF23的表达量，结果显示在SNU407、CACO2、RKO中KIF23表达量较其他细胞系高（图1C）。综合考虑后，选择RKO细胞系进行后续细胞实验。

图1 KIF23在结直肠癌组织及其癌旁正常组织、细胞系中的表达Fig.1 Expression of KIF23 in colorectal cancer and its adjacent normal tissues and cell lines

进一步验证临床样本中KIF23表达水平与结直肠癌患者临床病理特征的关系。根据结直肠癌组织中KIF23表达水平的中位数（0.00697）将患者分为高表达组（n=10）和低表达组（n=10），结果显示KIF23表达水平与结直肠癌患者性别、年龄、肿瘤大小、分化程度等均无关（均P＞0.05），但与患者发生肿瘤转移、CEA水平和CA199水平相关（均P＜0.05），见表1。表明KIF23在结直肠癌组织中升高，可能是结肠癌患者的预后生物标志物。

表1 KIF23表达与结直肠癌患者临床病理特征的关系（n）Tab.1 Relationship between expression level of KIF23 and clinical characteristics of colorectal cancer patients(n)

2.2 结直肠癌RKO细胞中沉默KIF23的鉴定

通过使用siRNA转染技术沉默KIF23在RKO细胞中的表达，并通过RT-qPCR及Western blot分析各组的KIF23表达水平（图2）。根据RT-qPCR检测结果计算得出siKIF23#1和siKIF23#2的敲除效率分别为94.2%和99.6%，根据Western blot检测结果计算得出siKIF23#1和siKIF23#2的敲除效率分别为45.2%和72.7%。基于以上结果，选用敲除效率较高的siKIF23#2组为实验组（siKIF23组）进行后续实验。

图2 siRNAs转染后RKO细胞中KIF23的表达Fig.2 Expression of KIF23 in RKO cells after siRNAs transfection

2.3 沉默KIF23对结直肠癌RKO细胞增殖、迁移的影响

通过CCK-8实验、EDU实验检测沉默KIF23对RKO细胞体外增殖能力的影响。CCK-8实验结果（图3A）显示，与siNC组比较，siKIF23组中在48 h和72 h时RKO细胞增殖能力均被显著抑制（P=0.0087，P＜0.0001）。EDU实验结果（图3B～C）显示，与siNC组比较，siKIF23组中RKO细胞增殖能力被显著抑制（P=0.0013）。使用Transwell小室实验检测细胞迁移能力，结果（图3D～E）显示，与siNC 组比较，siKIF23组中RKO细胞迁移个数显著减少（P=0.0043）。以上结果表明沉默KIF23能抑制结直肠癌细胞的体外增殖和迁移能力。

图3 沉默KIF23对结直肠癌RKO细胞增殖、迁移的影响Fig.3 Effect of silencing KIF23 on the proliferation and migration of colorectal cancer RKO cells

2.4 沉默KIF23对结直肠癌RKO细胞中MDM2、p53、p21蛋白表达水平的影响

为了探讨MDM2-p53/p21信号通路是否参与KIF23调控的结直肠癌的恶性表型，利用Western blot检测siNC组和siKIF23组中MDM2、p53和p21的蛋白表达变化情况，结果（图4）显示，沉默KIF23基因后，RKO细胞中MDM2蛋白表达水平显著下调（P＜0.0001），而p53和p21的蛋白表达水平均显著上调（均P＜0.0001）。

图4 沉默KIF23对结直肠癌RKO细胞中MDM2、p53和p21蛋白表达的影响Fig.4 Effect of silencing KIF23 on the expression of MDM2,p53 and p21 proteins in colorectal cancer RKO cells

3 讨论

结直肠癌的发生发展是一个多步骤的过程，目前其潜在分子机制尚不明确[14-15]。早期筛查、早期诊断和早期治疗是改善结直肠癌预后的关键[16]，但是由于缺乏特异性的指标以及检测手段，目前我国结直肠癌患者早期诊断及治疗率仍偏低[17]。因此，寻找可用于预测结直肠癌发生发展和预后预测的分子标志物成了研究者关注的热点。目前随着研究的不断进展和深入，与结直肠癌相关的多个新靶点如m6A[18]、EMT[19]和KIF20A[20]等相继被挖掘。KIF23是驱动蛋白家族的成员之一，是一种核蛋白，位于有丝分裂纺锤体之间，是胞质分裂的关键调节因子。既往研究显示KIF23表达失调会导致胞质分裂不完全及形成双核或多核细胞，与多种肿瘤的发生、进展和预后不良有关[5-6]，如 KIF23 在三阴性乳腺癌[21]、胃癌[22]、肝癌[23]、非小细胞肺癌[24]和弥漫性大B细胞淋巴瘤[25]等肿瘤中呈高表达，且与这些恶性肿瘤的不良预后结局有密切关系。本研究通过检测结直肠癌临床样本也发现，KIF23在结直肠癌中的表达显著高于癌旁正常组织，基于TCGA数据库分析也得出类似结果。进一步的临床分析结果显示，KIF23高表达与患者发生肿瘤转移、CEA及CA199高水平相关，提示KIF23可能与结直肠癌肿瘤进展密切相关，其表达量越高，越有可能发生侵袭转移。既往也有研究表明，KIF23高表达与结直肠癌患者预后不良有关，是影响其总生存期和无病生存期的独立危险因素[26]。综合以上研究结果提示KIF23可能是预测结直肠癌发生发展和预后的分子标志物。

目前认为KIF23可能通过多种作用机制参与肿瘤发生发展，如EMT[21]、Wnt/β-catenin[22]信号通路等，但其与MDM2-p53信号通路的关系有待深入探索。本研究使用靶向的siRNA使KIF23基因在结直肠癌RKO细胞中沉默，结果发现结直肠癌细胞的增殖、迁移等恶性行为受到抑制，且KIF23、MDM2蛋白表达量降低，而p53、p21蛋白表达量升高。考虑KIF23可能通过靶向蛋白-蛋白相互作用途径显著抑制MDM2的表达，使MDM2对p53的反向调控作用减弱，让原本表达较低的p53表达上调和下游的p21激活，而高水平的p53和p21可使细胞周期阻滞和迁移能力下降，从而使结直肠癌细胞增殖、迁移等恶性行为受到抑制。本研究的体外实验结果说明KIF23可能通过MDM2-p53/p21信号通路调节结直肠癌细胞的恶性生物学行为。

综上所述，KIF23在结直肠癌组织中高表达，其可能通过MDM2-p53/p21信号通路参与结直肠癌细胞的体外增殖、迁移等恶性生物学行为，有望成为结直肠癌预后预测指标及潜在的治疗靶点，为结直肠癌的诊断和靶向治疗提供新的思路。但是本研究的临床样本量有限，且仅在单一细胞系中进行实验，因此有关结论尚有待进一步验证。