主成分结合响应面法优化酒牛膝饮片均匀化工艺

胡婷婷，李金洋，翟俊杰，刘文苹，卢宝伟，孟祥松

（1.亳州学院中药学院，安徽亳州 236800；2.皖西学院，安徽六安 237012）

牛膝作为我国一种常用大宗药材商品，来源为苋科植物牛膝（Achyranthes bidentataBl.）的干燥根，主要产自河南，是著名的“四大怀药”之一。牛膝药性苦、甘、酸，平。归肝、肾经。具有逐瘀通经、补肝肾、强筋骨、利尿通淋、引血下行的功效，用于经闭、痛经、腰膝酸痛、筋骨无力、淋证、水肿、头痛、眩晕、牙痛、口疮、吐血、衄血[1]。现代研究表明，牛膝在抗肿瘤[2]、抗炎镇痛[3]、抗骨质疏松[4]、降血糖[5]、保肝[6]和增强免疫[7]等方面均具有显著的药理作用。牛膝酒炙之后可增强活血通络的作用，用于经闭癥瘕、腰膝酸痛、筋骨无力等。

由于现有标准物质在表征质量信息时具有一定的局限性，所以常用的化学对照品、对照药材及对照提取物均无法完全反映出中药饮片的科学内涵与特征属性，而中药标准饮片的出现恰好填补了现有标准物质的缺口[8]。利用中药标准饮片作为标准物质可实现对饮片药效物质群的整体控制，以此制定的饮片质量标准才更具有科学性和实用性[9]。中药标准饮片的均匀性是保证其质量的重要条件之一，目前尚未见关于酒牛膝饮片均匀化研究的报道，而笔者在研究前期对市场上现有的牛膝对照药材粉末进行调查，发现均有不同程度的结块、泛糖等现象。因此，本实验结合前期调研基础参考牛膝对照药材的粉碎方式，以牛膝出粉率、β-蜕皮甾酮、25R-牛膝甾酮、25S-牛膝甾酮为指标，应用主成分分析求得总因子得分（F），以F为综合指标，采用响应面法对牛膝饮片均匀化工艺中的投料量、打粉次数、每次打粉时间进行优化，筛选其最佳均匀化工艺，以期为酒牛膝饮片均匀化技术规范的制定提供全面的参考依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

药典2～6 号筛（浙江上虞市五四仪器筛具厂）;FW-200 型高速万能粉碎机(北京中兴伟业仪器有限公司);GX-800 型鼓泡清洗机（杭州海善制药设备有限公司）;高效液相色谱仪（waters waters 2487UV 检测器）;QRZG-300型直线往复式切药机（杭州海善制药设备有限公司）；CG-600Z 型自控温鼓式炒药机（杭州海善制药设备有限公司）；十万分之一电子分析天平（BT25S赛多利斯科学仪器有限公司）。

1.2 材料

牛膝样品购于河南省武陟县大丰乡架部四村，为苋科植物牛膝（Achyranthes bidentataBl.）的干燥根；25R-牛膝甾酮和25S-牛膝甾酮对照品（成都普菲德生物技术有限公司，批号分别为210414,210720）；β-蜕皮甾酮（成都普思生物科技股份有限公司，批号PS-21062801）；水为超纯水，甲醇、乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

2 样品制备

2.1 酒牛膝饮片的制备

取牛膝药材，放置于挑选工作台上。拣去药材中的杂质、异物、非药用部分后装入洁净容器内，用水冲洗，至无泥沙，用湿纱布覆盖，放置3 h，将牛膝切成规格为3～4 mm 厚片，摊放在温度为60 ℃的烘箱中烘干，干燥时间为4.5 h。加入0.1 倍的黄酒，拌匀，闷1 h 至黄酒被吸尽。将拌匀闷透后的牛膝置预热好的热锅中，温度为90～110 ℃炒15 min 至干，有酒香气，取出，晾凉备用。

3 方法与结果

3.1 粉碎粒径考察

取酒牛膝饮片适量，采用打粉机粉碎，粉末采用10、24、50、65、80、100 目筛处理，分为未过10、10～24、24～50、50～65、65～80、80～100、100～200 目筛7 组(编号J0、J1、J2、J3、J4、J5、J6)，参照前期实验成果[10]中甾酮类成分含量测定方法进行测定具体实验结果见表1，不同粒度色谱叠加图见图1。

图1 酒牛膝不同粒径粉末叠加色谱图

表1 酒牛膝样品中β-蜕皮甾酮、25R-牛膝甾酮、25S-牛膝甾酮含量测定结果

分别以酒牛膝不同粒度粉末为横坐标，以上述实验测定结果中的β-蜕皮甾酮、25R-牛膝甾酮、25S-牛膝甾酮的含量为纵坐标绘制折线图，见图2。

图2 酒牛膝不同粒度下有效成分含量折线图

酒牛膝粉末的三种甾酮类含量随着粒径变小，呈现上升趋势，随着粉碎粒度的增加最后呈现下降趋势，并且表现在过50～65 目(3 号筛)下含量最高，在预试验时将粉末粉碎至200 目耗时长，且大于200目的收率较小，因此考虑将其均匀化的粉碎工艺粉末粒度定为过3号筛。

3.2 单因素试验

3.2.1 投料量的选择

分别称取酒牛膝饮片20、30、40、50、60、70、80 g，采用FW-200型高速多功能粉碎机，在26 000 r/min转速下，粉碎1次，粉碎时间均为30 s，过3号筛，称通过3号筛药粉重量，记为出粉量，计算出粉率。结果见表2。

表2 投料量对出粉率的影响

3.2.2 打粉次数的选择

称取酒牛膝饮片60 g，采用FW-200 型高速多功能粉碎机，在26 000 r/min 转速下，每次粉碎时间为10 s，粉碎多次，直至不能粉碎为止，过3 号筛，称药粉重量，记累计出粉量，累计出粉率和每次出粉率见表3。

表3 打粉次数对出粉率的影响

3.2.3 每次打粉时间的选择

称取牛膝饮片60 g，采用FW-200 型高速多功能粉碎机，在26 000 r/min 转速下，打粉3 次，每次粉碎时间分别为5、10、15、20、25、30 s，计算总出粉率和每次出粉率，结果见表4。

表4 每次打粉时间对出粉率的影响

3.3 响应面试验设计

在单因素试验的基础上，确定各因素的最佳水平范围，采用响应面中心组合试验设计，以投料量(A)、打粉次数(B)、每次打粉时间(C)为自变量，以F值为响应值，其因素水平编码见表5。

表5 试验因素水平编码表

3.4 牛膝甾酮类有效成分含量的测定

结合前期研究成果参照文献[10]对17 组实验进行酒牛膝中牛膝甾酮类有效成分含量测定，最终实验结果见表6。

表6 实验结果

3.5 PCA分析

（1）主成分提取及其贡献率的计算：将上述表中响应面实验的结果输入SPSS 22.0 软件，进行PCA，总方差的解释见表7，主成分系数矩阵见表8。

表7 解释的总方差

表8 成份矩阵

软件默认特征值大于1 的成分作为主成分，由表6 知，第1 个成分（出粉率）的初始特征值大于1，但其对总方差的累计贡献率只有76.084%，偏小，若提取前2 个成分（出粉率和β-蜕皮甾酮），累计贡献率可达到99.689%，可以保留原始变量的大部分信息，因此选取前2 个成分作为分析所用的主成分。

（2）F值的计算：以主成分因子得分与其方差贡献率乘积之和相加，可以得出各试验组的F，F的计算公式为F=F1×0.76084+F2×0.23605，其中主成分的表达式可以由表8 中的成分矩阵推出，前2 个主成分的表达式分别为：F1=-0.1645×Z1+0.5694×Z2+0.5702×Z3+0.5689×Z4，F2=0.9859×Z1+0.0923×Z2+0.0727×Z3+0.1200×Z4.

按照以上公式计算响应面法试验各组的F值，F值的结果见表9。

表9 响应面试验方案及F值结果

使用Design-Expert8.06软件进行回归模型分析及显著性检验，结果得出投料量、打粉次数、每次打粉时间与F值的多项回归方程，回归方程为：Y=-5.90513+0.12543A+4.0014B+0.4719C-1.375×10-3AB-2.5×10-5AC-0.0555BC-1.09625 × 10-3A2-0.34338B2-5.835×10-3C2,方差分析及系统显著性检验见表10。

表10 响应面方差分析

由表10 可知模型的P=0.0003,说明该回归模型显著，用该模型分析各因素对F值的影响具有意义。回归系数模型显著性检验结果可以看出：模型中一次项中B（打粉次数）C（每次打粉时间）具有显著性，交互作用BC显著，二次项中B2、C2具有显著性，按照对结果的影响大小排序为：打粉次数＞每次打粉时间＞投料量，通过求解回归方程，得出酒牛膝饮片最佳均匀化条件为投料量为60 g，打粉次数为3 次，每次打粉时间为20 s，各因素相互作用响应曲面图和等高线图见图3。

图3 各因素相互作用等高线图和响应曲面图

3.6 验证试验

在上述优化的最佳均匀化工艺条件下进行3 次试验，实验结果平均值与理论预测值相对误差小于5%，说明该方程与实际结果拟合良好。

4 讨论

针对酒牛膝对照药材粉末容易“泛糖”等目前常见的问题，对其进行研究。粉碎时间考察范围为5～30 s 时，总出粉率和总出粉量会随着粉碎时间不断地增加也不断地增大。每次粉碎时间为10 s 时，投药量为60 g，随着打粉次数的不断增加，总出粉量和总出粉率不断增加，但各出粉率增加值均呈缓慢下降趋势。投料量考察范围在20～ 60 g 时，总出粉率会随着投料量的增加而增加，而当投料量达到60 g 以上的时候，出粉率反而降低。采用主成分分析及响应面法进行筛选，优选出酒牛膝均匀化饮片的最佳工艺为投料量60 g，打粉3次，每次打粉时间20 s。该方法最大程度地避免酒牛膝粉末成块泛糖等现象，为酒牛膝饮片及其他类似饮片的质量控制提供了一种新的更加专属、科学、客观的标准物质实验参考。

酒牛膝饮片均匀化工艺的应用既避免了化学对照品分离难度大、供不应求等问题，又能够较牛膝对照药材反应更全面、更准确的饮片内在属性信息，与中医特色相吻合，是适合饮片质量评价的最佳标准物质。

牛膝为临床上常用的饮片，而通过酒炙之后其补肝肾强筋骨功效会增强，因此，酒牛膝饮片的质量控制需要更为严格的标准。目前，市场上很多对于酒牛膝饮片对照物如对照药材都是在原药材的基础上进行粉碎，忽略了炮制对于饮片的影响，饮片中成分的复杂、复方中不同中药成分之间的相互作用，导致很难在短时间内研究清楚牛膝饮片的有效物质基础，而酒牛膝均匀化工艺能够避免这一困难，从宏观上控制酒牛膝饮片的质量。