淋巴细胞亚群在儿科临床的应用

熊晓，余理，冯园，贺丰，周银飞

国内2016年首次发表“流式细胞术分析外周血淋巴细胞亚群在儿科的临床应用专家共识”，经2019年第二次修正，经过数年的普及推广，已经成为儿科临床工作中常见的免疫评估工具[1]。常规的淋巴细胞亚群分析包括：T细胞(CD3+)、B细胞(CD3-CD19+)和NK细胞(CD3-CD16+CD56+)；T细胞又分为辅助性T细胞(CD3+CD4+)和杀伤性T细胞(CD3+CD8+)；以及各个亚群细胞的相对计数(百分比)和绝对计数，将两者结合起来对患儿的免疫功能进行判别。一方面可以了解患儿发生疾病时免疫功能变化，提高免疫缺陷病的检出率；另外掌握病程中患儿免疫功能变化，可以辅助指导免疫调节剂使用；而对感染后的免疫系统进行评估，可以了解病情的进展，判定感染者的治疗效果，合理调整药物使用。不同于成人，儿童外周血淋巴细胞绝对计数和相对百分比变化程度较大，受年龄、环境、发育和疾病等因素的影响，因此对儿童进行免疫功能的检测十分重要。一项针对中国健康儿童淋巴细胞亚群正常参考值研究指出，CD4和CD8T细胞亚群的百分比和数量有明显的年龄特异性变化[2]。随年龄增长，幼稚CD4T细胞的比例逐渐减少，而记忆CD4T细胞的比例增加；幼稚B细胞在1至6个月的婴儿中最高，在4至8岁的儿童中最低，在8-18岁的儿童中达到了一个平台期；出生后第一年记忆B细胞稀少，这是对T细胞独立抗原的抗体反应短暂不成熟所致，是儿童这一时期的特征性表现；而中国不同地理群体间的淋巴细胞主要亚群分布无统计学差异[2]。

1 淋巴细胞亚群在儿童感染性疾病中的应用

1.1 呼吸道感染性疾病

机体免疫系统是一个监视、防护和稳定体系，正常情况下可通过各种免疫应答反应来有效防御病原体的侵袭。不同的免疫应答途径会使淋巴细胞亚群水平出现不同变化。相较于成人，儿童对感染的免疫反应通常更为活跃。有研究发现无论细菌感染还是病毒感染患儿，均表现出外周血CD3+T、CD8+T细胞减少，CD4+/CD8+升高的现象[3]。相比链球菌、流感嗜血杆菌感染，金黄色葡萄球菌感染更容易引起 CD8+T细胞减少，CD4+/CD8+比例升高，且NK比例明显升高；与人副流感病毒感染患儿相比，呼吸道合胞病毒、腺病毒感染患儿CD8+T细胞减少更明显。提示呼吸道感染患儿中出现免疫功能失调现象，机体对抗原的杀伤力明显降低，无法很好地清除细菌、病毒。在免疫能力强的儿童，即使是在单纯上呼吸道感染的情况下，腺病毒也能激活强大的全身炎症反应，在感染的急性期，即使是轻症患儿，淋巴细胞亚群也表现为B淋巴细胞百分比和绝对数的增加，从而引起血清炎症因子的升高。淋巴细胞亚群的构成和血清学的改变，是腺病毒感染后引起抗生素滥用的主要原因[4]。指南建议接受化疗的儿童每年接种流感疫苗，而CD4+T在正常年龄范围的患者在接种后抗体滴度升高，且对H1N1和H3N2毒株的反应更好。在高度免疫抑制患者中，NKT样细胞计数和流感毒株的特异性抗体反应之间存在关联。大于1000/ul的绝对淋巴细胞计数对疫苗注射后抗体滴度的增加更有益处[5]。有研究发现难治性肺炎支原体肺炎(RMPP)淋巴细胞亚群异常率明显高于普通型肺炎支原体肺炎(GMPP)。RMPP组患儿发生 CD3+T细胞及NK细胞的绝对计数和百分比减少的患儿比例显著高于GMPP组，主要以 CD4+T细胞百分比减少为主，而两组 CD8+T细胞变化差异无统计学意义。因此推测CD4+T和NK 细胞可能与MP疾病的严重程度相关，是参与RMPP致病的免疫机制之一[6]。活动性结核病患儿CD3+T、CD4+T细胞的百分比与绝对计数及CD8+T细胞绝对计数均低于健康对照儿童，且重型活动性结核病患儿更低于非重型患儿[7]。肺外结核病组患儿外周血 CD4+T细胞水平显著低于肺内结核病组，CD3+T细胞及CD4+/CD8+T细胞比值也有所下降，说明肺外结核病组患儿中存在更为强烈的免疫抑制现象[8]。Li等[9]在对感染2019-nCoV的患儿进行淋巴细胞亚群分析发现，RSV感染患儿的CD8+T细胞计数明显低于健康对照组；与RSV肺炎患儿相比，2019-nCoV肺炎患儿CD3+CD8+T细胞计数及百分比更高；而2019-nCoV重症肺炎患儿CD3+CD8+淋巴细胞计数及百分比均降低。推测重症患者出现T细胞功能的耗竭，而有效的CD8+T细胞激活是2019-nCoV肺炎患儿肺炎症状大多为轻至中度的原因之一。Carsetti 等[10]在研究儿童抵抗新型冠状病毒的免疫机制时发现儿童比成人体内存在更为丰富的记忆B细胞，可结合不同未知微生物后产生大量天然抗体并分泌抗炎细胞因子，从而对新抗原迅速发生反应，减少肺组织的损伤。而随着年龄增长等原因，这种固有免疫的能力逐渐降低，这或许能为解释儿童2019-nCoV肺炎症状较成人轻提供新的依据。

1.2 脓毒症

脓毒症主要是宿主对感染的反应失调导致的危及生命的器官功能障碍。有研究发现感染后机体出现免疫功能抑制与脓毒症患者发生院内感染和死亡风险增加相关[11]。与健康儿童相比，脓毒症患儿外周血中CD4+T细胞的数量下降，CD8+T细胞显著增多，尤其是CD3+CD8+HLA-DR+细胞水平显著升高[12]。住院时间更长的患儿变化更明显。因此推测CD4+T 细胞的活化和增殖减低，以及CD8+T细胞的过度活化和增殖在脓毒症的发病机制中起重要作用。CD3+CD8+HLA-DR+/CD3+CD4+CD25+比例升高与脓毒症的病程延长有关。CD4+/CD8+降低提示免疫功能下降，脓毒症院内感染组CD4+/CD8+比例明显低于无院内感染组[13]。感染患者术前CD4+/CD8+越低，术后并发脓毒症的概率越高[14]。血液病合并脓毒血症患儿外周血 CD3+T淋巴细胞及CD3+CD4+T淋巴细胞数量较对照组明显下降，CD3+CD8+T细胞数量明显增多[15]。在脓毒症患者，外周血白细胞数量在脓毒症过程中有明显的波动。早期白细胞或淋巴细胞减少的调节失败与患者死亡率增加相关，虽然在脓毒症发病后的头2～4天内可以观察到中性粒细胞和单核细胞数量显著增加，但淋巴细胞减少状态很快就会随着细胞因子风暴的消除而消失[16]。脓毒症患者因细胞凋亡导致CD4+T细胞和NK细胞数量明显减少，幸存者的淋巴细胞数量在一个月内恢复正常，但免疫细胞的功能会在一段较长的时间内降低，由于长期的功能损伤，先前脓毒症患者对继发性感染和病毒再活化的易感性增加，导致预期寿命缩短[17-18]。

1.3 传染性单核细胞增多症

传染性单核细胞增多症(infectious mononucleosis，IM)IM和慢性活动性EB病毒(Chronic active EBV，CAEBV)感染同样存在复杂的免疫功能紊乱。与健康儿童相比，IM患儿的CD3+、CD4+、CD8+水平升高，而NK细胞和B细胞水平较低，在CAEBV组CD3+、CD4+、CD8+、NK细胞和B细胞水平均降低，且NK细胞和B细胞低于IM组[19]。研究表明，EBV可以引起NK细胞丧失清除病毒的能力，促进T细胞的增殖，并形成强大的细胞免疫反应，从而识别和促进感染的B淋巴细胞凋亡[20-21]。此外，这一过程也可以抑制B淋巴细胞的增殖和分化[22]。因此，在EBV感染的急性期，患者可能会表现出T淋巴细胞明显的增加，有助于EBV病毒的清除，如果没有及时有效的治疗，T淋巴细胞和B淋巴细胞之间的相互作用可以增强，并且B细胞活化进一步受到限制，使EBV难以清除，导致持久EBV感染[19]。在另一项研究中证实了IM患者外周血总T细胞、CD8+T细胞和DPT(CD4+CD8+T)细胞显著增加，B细胞数量相对计数和绝对计数均减少[23]。有研究发现在IM患儿，外周血CD8+T细胞和DPT细胞的绝对数量与LDH浓度显著正相关，而CD4+T、B、NK细胞百分比与LDH浓度呈负相关。与其他类型的急性肝炎相比，EBV相关性肝炎的LDH水平较高[24]，因此推测外周血CD8+T细胞在评估EBV相关的IM患者严重程度方面可能具有重要作用。短期抗病毒治疗后只有DPT细胞百分比和NK细胞绝对数量趋于正常，推测这两个值能更准确的作为辅助评价指标及时反映治疗情况[23]。

感染性疾病的淋巴细胞亚群变化见表1。

表1 感染性疾病与淋巴细胞亚群变化Table 1 Lymphocyte subsets alterations in infectious diseases

2 淋巴细胞亚群在儿童免疫紊乱相关疾病中的应用

2.1 川崎病

川崎病(Kawasaki disease，KD)的病因及发病机制目前并不明确，但越来越多的证据表明KD的发病机制是先天性和适应性免疫反应异常和失衡所致。然而，KD患者外周血中适应性免疫细胞的变化和功能仍存在争议。与正常对照组和恢复期KD患者相比，急性KD外周血标本中中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞等固有免疫细胞显著增加，而B、T细胞等适应性免疫细胞则显著降低。而恢复期KD患者冠状动脉组织中适应性免疫细胞，尤其是B细胞和CD8+T细胞亚群明显增多。这一结果表明适应性免疫细胞可以选择性地从外周血招募到冠状动脉，从而引起冠脉损伤[25]。有研究发现静脉用免疫球蛋白(intravenous immunoglobulins，IVIG)无反应患者与IVIG敏感患者 CD8+HLA-DR+T/CD8+CD69+T 细胞比值差异有统计学意义。IVIG可抑制CD8+T细胞的活化，过量的CD8+T 细胞活化可引起 IVIG 无反应，推测CD8+HLADR+T/CD8+CD69+T 细胞的比值可能成为预测IVIG 敏感性的指标[26]。在另一项研究中发现，急性KD患者CD8+T细胞的百分比减少，尤其是效应CD8+记忆T细胞，且这种改变不被IVIG影响。可能这种能对抗原发生快速反应的效应CD8+T细胞的缺乏是KD发生的一个危险因素[27]。有学者检测了KD及其他发热病人以及正常儿童的淋巴细胞亚群。相比正常儿童和其他发热患儿，KD患儿CD3+T、CD4+T，CD8+T淋巴细胞显著降低，然而，KD组与其他发热患儿组比较没有统计学差异。在IVIG注射前，注射完及注射后2周分别检测淋巴细胞亚群，在IVIG敏感组，注射后CD4+T细胞及CD8+T细胞均上升，且维持至2周后，而IVIG抵抗组在注射完后有短暂的上升后，2周后检测即发现细胞群的降低。但在3个不同的时间点，IVIG敏感组及IVIG抵抗组两组间淋巴细胞亚群比较，没有统计学差异。虽然各亚型NK细胞IVIG敏感组和抵抗组均呈增加趋势，但是在丙球注射前，CD56-CD16+NK细胞在两组间有显著差异。同样猜想CD56-CD16+NK可能成为预测 IVIG 敏感性的指标[28]。在 KD患者中，IVIG输注后活化的Treg细胞和CD25+CD56brightNK细胞比例增加，多个淋巴细胞亚群显示淋巴组织归巢受体CD62L表达增加。且IVIG治疗降低了细胞毒性CD56dimNK细胞中CD107a脱颗粒标志物的表达频率，显著减少了靶细胞的杀伤和多种促炎介质的产生。因此IVIG在治疗KD免疫失调患者时发挥着多重作用，尤其是对NK细胞亚群和CD4+T细胞[29]。

2.2 过敏性紫癜和肾病综合征

过敏性紫癜(henoch-Schonlein purpura，HSP)患儿体内存在淋巴细胞功能紊乱，与正常对照组相比，在紫癜肾炎(HSPN)组和HSP组，外周血CD3+、CD4+、CD8+T和NK细胞水平显著减少，CD19+B水平显著升高，而HSPN组变化比HSP组更大。提示HSPN患儿免疫功能障碍具体表现为细胞免疫功能低下，导致炎性介质分泌增多，激活B细胞，进而使免疫球蛋白分泌增多，导致小血管炎的发生[30]。目前HSP诊断和治疗主要根据临床症状决定，但在尿常规没有异常时早期肾脏损害并不能及早发现，对症治疗虽然能够缓解皮肤紫癜的症状，但其他症状尤其是肾脏损害的症状并没有缓解。临床研究证明，年龄越小的HSP患儿，如果在早期能够接受针对性的治疗，其肾脏损害的危险性就会降低，并能够减少紫癜性肾炎的发病概率[31-32]。有研究发现血清胱抑素C(CysC)和血栓调节素(TM)与CD3+、CD4+水平及CD4+/CD8+呈显著负相关，与CD8+水平呈显著正相关。联合CysC、TM、T淋巴细胞亚群的检测可提高对HSP患儿的准确诊断率，及早进行免疫学的干预[33]。肾病综合征(Nephrotic syndrome，NS)是儿童常见的肾小球疾病，其发病机制仍然是不清楚的。既往研究发现CD4+/CD8+T细胞的平衡在NS发病机制中发挥重要作用[34]。NS患儿CD3+T，CD4+T，CD4+/CD8+显著降低，且可能与疾病的发展和预后有关[35]。此外，NS患者的B淋巴细胞、NK细胞和NKT细胞明显减少[36]。在激素敏感型肾病综合(SSNS)和激素依赖(SDNS)/频复发(FRNS)肾病综合征中，外周血CD3+，CD4+，CD4+/CD8+均下降，其中SDNS/FRNS患儿降低更明显[37]。提示需要重视免疫细胞失衡在NS发病及激素治疗中的作用。

2.3 系统性红斑狼疮和幼年特发性关节炎

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)是一种复杂的、异质的免疫介导疾病。免疫紊乱在疾病的表型和预后结果中具有关键作用。与对照组相比，SLE患者CD4+T、yδT、NK细胞比例明显降低，CD8+T、NKT、CD19+B细胞比例明显升高。狼疮性肾炎(LN)中Treg的百分率显著低于非LN患儿和正常儿童，随访6个月时，Treg百分比显著升高。yδT细胞和NK细胞升高与黏膜溃疡明显相关，而CD4+T细胞升高与关节炎显著相关，NKT细胞升高与自身免疫性溶血性贫血相关，CD8+T细胞减低则主要与血管炎有关[38]。SLE可引起多种临床症状，有部分患儿以关节疼痛为首发表现，这与关节型JIA临床表现有相似之处。但两者可能有不同的炎症途径和免疫调节特征。有研究发现SLE患儿以CD8+T淋巴细胞异常表达为主，并与疾病活动正相关。幼年特发性关节炎(juvenile idiopathic arthritis，JIA)患儿则以CD4+T淋巴细胞异常升高为主，并且与JIA患儿关节滑膜炎症及局部关节软骨破坏有关。SLE患儿外周血中B淋巴细胞比例明显升高，引起自身抗体和细胞因子的过度分泌，导致患儿多系统损害。两者NK细胞比例均明显低于对照组，SLE组较JIA组降低却更为显著，这可能是导致SLE患儿更易并发感染，重者甚至导致死亡的重要原因[39]。

2.4 Graves病

Graves病(Graves’ disease，GD)是一种与T细胞和B细胞反应密切相关的自身免疫性疾病。研究发现在GD患儿血清ALT水平与CD8+T细胞百分比呈正相关；在发生凸眼症的患儿，其CD19+B细胞百分比和CD4/CD8比率较高，在有或没有血尿组之间比较，淋巴细胞亚群无差异。提示CD8+T细胞可能在GD患儿肝功能障碍的发病机制中起重要作用[40]。在自身免疫性甲状腺疾病中，Treg细胞通过调节局部免疫反应，活化CD8+T细胞促进甲状腺细胞的凋亡，由细胞裂解产物进一步促进T细胞增殖[41-42]。其中CD4+CD25+Forxp3+Treg能通过细胞因子和失能的T细胞抑制过强的免疫反应，升高循环血液中CD4+T细胞的数量和降低CD8+T细胞的数量来控制甲状腺的免疫损伤[43]。提示外周血淋巴细胞亚群免疫表型可为进一步了解自身免疫性甲状腺炎发病机制提供依据。

2.5 儿童HIV感染

暴露于人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)的未感染婴儿(HIV-exposed，uninfected，HEU)的淋巴细胞亚群与未接触和未感染HIV的婴儿(HIV-unexposed and uninfected，HUU)不同。与HUU婴儿相比，HEU婴儿在6～12月时CD4+T细胞计数更高，在3～12月时CD19+B细胞的绝对数量和百分比更高。B细胞可能在预防围产期HIV病毒传播中发挥保护作用[44]。长期非进展(long-term non-progressor，LPNT)与非长期非进展组(non-long-term non-progressor，nLTNPs)HIV 感染儿童的淋巴细胞亚群研究发现，nLTNPs中CD4+T细胞的绝对计数和百分比低于LTNPs。与对照组相比，两组细胞毒性T细胞都很高，自然杀伤(NK)细胞明显降低，幼稚B细胞升高[45]。在进展缓慢的HIV感染儿童中调节性T细胞活性增强和T细胞稳态信号转导增强，从而维持这些个体保持正常年龄段CD4计数水平，使疾病进展延缓[46]。有研究发现，在每日给予含干酪乳杆菌(LCS)的发酵乳(6.5×109CFU)8周后，外周血CD4+T细胞和Th2计数均明显增加，CD8+T细胞从27.5%下降到13.2%，血浆HIV载量下降[47]。

2.6 普通变异型免疫缺陷病

普通变异型免疫缺陷病(common variable immunodeficiency，CVID)的特点是反复感染，自身免疫，淋巴细胞增生，低γ球蛋白血症，抗体产生缺陷。儿童期起病的CVID比成人少见且淋巴细胞亚群异常未被彻底评估。儿童CVID患者CD19+B细胞的绝对数量和百分比以及CD4+/CD8+比值明显低于年龄匹配的健康对照组。其CD4+T细胞、CD4+CD45RA+naive T细胞、RTE细胞比例较对照组降低。T，B和NK细胞异常与患者临床表型的关系为：CD8+T细胞比例上升，CD19+B细胞和NK细胞的下降和CVID患者发生支气管扩张相关；naiveCD4+T细胞和RTE细胞百分比的降低是儿童CVID患者发生慢性腹泻的危险因素。具有自身免疫性疾病或淋巴细胞增生的CVID患者与无自身免疫性疾病或淋巴细胞增生的患者在各型细胞亚群上无显著差异[48]。尽管潜在的遗传缺陷可能会对观察到的改变产生影响，但这些B细胞和T细胞间中的一些异常似乎与某些终末器官功能受损有关。

免疫相关性疾病的淋巴细胞亚群变化见表2。

表2 免疫相关性疾病与淋巴细胞亚群变化Table 2 Lymphocyte subsets alterations in immunological disorder

综上所述，儿科许多疾病中存在免疫功能紊乱是毋庸置疑的，但淋巴细胞亚群的变化在其中扮演的角色以及与临床症状之间的相关性并没有明确结论。目前淋巴细胞亚群分析是临床除免疫球蛋白及补体检测外最能评估患儿免疫功能状态的指标，本文概述了儿科常见感染性疾病及免疫紊乱相关疾病中淋巴细胞亚群的情况，为更好的应用和掌握淋巴细胞亚群分析这一免疫评估工具提供了有效的参考依据。未来的研究期待能进一步阐明免疫紊乱与不同疾病临床表型之间的关系，为更好地进行临床管理提供有效依据。