超声辅助酶解促进草鱼鳞胶原肽水解进程的内在机制解析

熊 喆，赵 钰，秦子波，王希搏，荣建华，熊善柏,，胡 杨,

超声辅助酶解促进草鱼鳞胶原肽水解进程的内在机制解析

熊 喆1,2，赵 钰1,2，秦子波1,2，王希搏3，荣建华1,2，熊善柏1,2,3，胡 杨1,2,3※

（1. 华中农业大学食品科学技术学院，武汉 430070；2. 国家大宗淡水鱼加工技术研发分中心，武汉 430070；3.湖北省生物活性肽工程研究中心，荆州 434000）

为探究超声辅助酶解促进草鱼鳞胶原肽水解进程的内在原因，分别研究了超声对底物蛋白（草鱼鳞）的分子结构、表面疏水性、粒径等理化特性和蛋白酶酶解能力的影响机制，在此基础上，对超声酶解进程进行了动力学拟合，从酶解动力学角度进一步评估了促进草鱼鳞胶原肽水解进程的“超声-酶”耦合效应。结果表明，适当的超声强度（300 W、20 min）可以使底物蛋白的结构展开，此时其表面疏水性最大、粒径最小，使之更适合后续酶解，但当超声功率大于300 W时，底物蛋白会重新聚集，其中的部分疏水基团被掩埋，不利于酶解的进行。同时，当超声功率为300 W、时间为20 min时，单酶酶解组和分步酶解组的酶解能力从2.35×105、3.41×105U/g分别提高至3.44×105、3.86×105U/g，且表现出显著性差异（<0.05）。通过动力学模型对超声辅助单酶酶解（2=0.988 8）和分步酶解进程（2=0.960 7）进行了动力学拟合，依据建立的反应动力学方程，证实了超声辅助分步酶解进程更快，研究结果为超声辅助酶解工艺制备胶原肽提供了一定理论基础。

超声；酶；单酶酶解；分步酶解；酶解进程；动力学拟合

0 引 言

胶原肽是一种介于氨基酸和蛋白质之间的物质，是胶原变性后降解得到的产物[1]。胶原肽具有抗氧化、抗衰老、降血压、降血糖等多种生理活性功能，在医药、食品、化妆品领域有着广阔的应用前景[2]。目前，胶原肽的制备方法主要分为化学法水解、亚临界法水解以及酶解法3种方式，在提取胶原肽的过程中，化学法水解在制备过程中会产生大量中性盐且易腐蚀设备；亚临界法水解能耗较高且设备较为复杂，酶解法因其反应条件温和、水解程度相对较高和对环境污染小等优点，被广泛应用于生产实践[3-6]。然而传统酶解法加酶量大且酶解效率较低，因此研究如何进一步提高酶解效率有着十分重要的意义。

在实际提取过程中，不同提取方法之间互相结合可以得到更好的提取效果，因此，为了进一步提高胶原肽的提取效率，改善产品品质，国内外许多学者采用了将物理化学加工手段和酶解相结合的加工方式，其中超声辅助酶解法就是一种行之有效的催化方法和技术手段。超声辅助提取的主要原理是利用超声的空化效应、热效应和机械作用改变或者破坏大分子的结构，从而提高提取效率[7-9]。超声辅助酶解分为超声作用于原料改性、超声作用于酶改性和超声作用于酶解过程三种作用模式[10-12]。当前的研究多局限于超声对底物蛋白的预处理过程，而采用超声作用于酶解过程模式的研究未见深入报道[13-14]。

在本研究室前期采用超声辅助酶解方式制备草鱼鳞胶原肽时发现，不同超声条件协同单酶/分步酶解方式能显著提升草鱼鳞胶原肽的水解进程，但其内在作用机制尚不明确[15]。基于此，本研究拟分别从超声对底物蛋白结构和对蛋白酶酶解能力的影响两个层面探索超声影响酶解进程的内在原因，并对酶解过程中水解度-时间进行动力学拟合，探究超声对酶解进程的影响规律，以期为基于超声辅助酶解制备胶原肽的工艺优选提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

草鱼鳞片购于华中农业大学菜市场，鱼质量和身长分别为(3 500±500) g，(600±30) cm；碱性蛋白酶(200 U/mg)、风味酶(20 U/mg)均为生物试剂，购于上海源叶生物科技有限公司；乙酸、8-苯胺基-1-萘磺酸钠、甲醛、氢氧化钠、酚酞、三氯乙酸、福林酚、碳酸钠、盐酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、酪蛋白、酪氨酸均为分析纯，购于国药化学试剂有限公司。

1.2 主要仪器设备

搅拌式超滤杯，美国密理博公司；FD-2A型真空冷冻干燥器，北京博医康实验仪器有限公司；HH-2数显恒温水浴锅，常州澳华仪器有限公司；J-1500圆二色谱仪，日本佳司科公司；Nicolet470傅里叶变换红外光谱，美国尼高力公司；紫外分光光度计，日本岛津公司；J-26XP高速冷冻离心机，美国贝克曼库尔特公司；F-4600型荧光光谱仪，日本日立公司；马尔文Nano ZS90 纳米粒度电位仪，英国马尔文帕纳科公司。

1.3 试验方法

1.3.1 不同超声条件处理的草鱼鳞制备

超声辅助酶解法制备草鱼鳞胶原肽的工艺流程如图 1所示。

1）草鱼鳞预处理：参照吴潇扬等[16]的方法采用0.1 mol/L氢氧化钠溶液和0.5 mol/L盐酸溶液对100 g草鱼鳞进行脱钙处理，然后用0.5mol/L碳酸氢钠溶液进行脱脂处理。酶解前将鱼鳞在85 ℃的热水中浸泡1.5 h，并用料理机搅碎[17]。

2）准确称取一定质量预处理过的草鱼鳞，加入蒸馏水调节底物浓度，在不同超声条件下处理一定时间后，取出冻干，冻干样备用。

以实验室前期赵钰等[15]优选出的超声辅助单酶酶解/分步酶解的较佳工艺条件为基础，考察超声对鱼鳞样品、酶和酶解进程的影响。超声辅助单酶酶解的试验条件为：碱性蛋白酶用量为420 U/g，酶解温度为60 ℃，初始 pH值为8.0～8.5，酶解时间为4 h，在酶解过程中分别施加20 min不同功率（0～600 W）的超声。超声辅助分步酶解的试验条件为：第一步酶解的碱性蛋白酶用量为420 U/g，酶解温度为60 ℃，初始 pH值为8.0～8.5，酶解时间为3 h；第二步酶解的风味酶用量为420 U/g，酶解温度为60 ℃，酶解时间为2 h，在酶解过程中施加300 W、20 min的超声，不同处理方式的超声时间分布如表1所示。

图1 超声辅助酶解法制备草鱼鳞胶原肽的工艺流程

表1 超声辅助分步酶解制备胶原肽的处理条件

注：FB：传统分步酶解；F20：第二步酶解过程中施加300 W、20 min超声；J10：两步酶解过程各施加300 W、10 min超声；J20：第一步酶解过程施加300 W、20 min超声。下同。

Note: FB: Traditional process of stepwise enzymatic hydrolysis; F20: A total of 300 W, 20 min of ultrasound treatment was applied during the second step of enzymatic hydrolysis; J10: The 300 W, 10 min of ultrasound treatment was applied during the first and second step enzymatic hydrolysis respectively; J20: A total of 300 W, 20 min of ultrasound treatment was applied during the first step of enzymatic hydrolysis. The same below.

1.3.2 底物蛋白结构表征及粒径、表面疏水性分析

1）红外光谱扫描：底物蛋白红外光谱分析参考Liu等[18]的方法进行。

2）紫外光谱扫描：将冻干样品用0.1 mol/L乙酸配制成1 mg/mL溶液，于190～600 nm范围内进行紫外全波长扫描。

3）内源荧光光谱扫描：将冻干后的样品溶解在0.1 mol/L的乙酸溶液中配制成0.5 mg/mL的溶液，进行荧光光谱扫描。扫描条件：激发波长280 nm，发射波长300～500 nm，狭缝宽度2.5 nm。

4）底物蛋白圆二色性及二级结构的测定：参照Song等[19]的方法并略作修改：将样品用0.1 mol/L乙酸溶液溶解，配制成0.5 mg/mL溶液，在190～250 nm波段内进行圆二色谱扫描，扫描速率为50 nm/min，响应时间为1 s，利用杨氏方程计算二级结构百分比。

5）底物蛋白粒径的测定：将冻干样品用0.1 mol/L乙酸溶液配制成0.1 mg/mL的样液，使用马尔文Nano ZS90纳米粒度电位仪分析测定样品的粒径分布，测定温度为25 ℃。

6）底物蛋白表面疏水性的测定：样品表面疏水性的测定参考杨恒等[20]的方法并略作修改：称取0.1 g冻干的蛋白样品，用0.1 mol/L的乙酸溶液配制成蛋白浓度为1 mg/mL的溶液，随后离心取上清液，用福林酚法测定其蛋白浓度，并将其稀释。取1.0 mL蛋白溶液与5 mL 8.0 mmol/L的8-苯胺-1-萘磺酸钠（8-Anilino-1- naphthalenesulfonic Acid，ANS）磷酸盐缓冲液（0.01 mol/L，pH值为7）混匀，避光反应2 min测定其相对荧光强度。激发波长为371 nm，发射波长为466 nm，扫描速率为240 nm/min，狭缝宽度为10 nm，以蛋白质质量浓度对荧光强度作图并进行线性拟合，直线斜率为表面疏水性指数。

1.3.3 蛋白酶酶解能力的测定

参照国标GB/T23527—2009测定超声辅助单酶酶解组和超声辅助分步酶解组的酶解能力[21]。

1.3.4 酶中间体的验证

荧光相图法参考黄珊芬[22]的方法稍作修改：将酶解后的蛋白酶溶液进行荧光光谱测定，扫描条件：激发波长280 nm，狭缝宽度10 nm，扫描范围300～400 nm，扫描速度1 200 nm/min。读取荧光发射光谱320 nm和365 nm的荧光强度320和365，然后以320为横坐标，365为纵坐标，进行线性拟合。

1.3.5 酶解过程动力学方程的拟合

1）酶解过程中酶解液水解度的测定

采用甲醛滴定法[23]测定酶解液中的氨基态氮含量和原料中的总氮含量。按下式计算水解度：

2）动力学方程的拟合

参考余筱洁等[24]的方法，水解度和水解时间的关系方程为：

式中为水解度，%；为水解时间，min；为初始水解速率，g/(mL·min)；为水解速率，g/(mL·min)。

1.4 数据处理

用SPSS软件进行数据处理和显著性分析，显著性分析取95%置信度（<0.05），数据结果均表示为：平均值±标准差（`SD）；使用Origin 2017软件作图。

2 结果与分析

2.1 超声对底物蛋白理化特性的影响

2.1.1 超声对底物蛋白傅里叶变换红外光谱的影响

从本实验室前期[15]优选出的超声辅助单酶酶解/分步酶解的较佳工艺条件可知，超声辅助单酶酶解的较佳工艺为在碱性蛋白酶酶解过程中施加300 W、20 min的超声；超声辅助分步酶解的较佳工艺条件为在碱性蛋白酶酶解过程中施加300 W、10 min的超声，然后在风味酶酶解过程中施加300 W、10 min的超声。以不同超声条件处理的草鱼鳞底物蛋白为对象考察了超声对底物蛋白的傅里叶变换红外光谱的影响，如图2所示。从图谱中可以看出，超声主要影响酰胺A带（N-H键的伸缩振动）的出峰位置[16]。对于超声辅助单酶酶解过程，不同超声功率对底物蛋白的影响主要体现在酰胺A带出峰位置的偏移会随着超声功率的增加先蓝移后红移，底物蛋白的酰胺A带从3 296.62 cm-1（未超声组）蓝移至3 315.04 cm-1（300 W超声组）而后又红移至3 298.73 cm-1（600 W超声组）。对于超声辅助分步酶解的过程，不同超声条件对底物蛋白的影响主要体现在相较于未超声组，超声组酰胺A带发生了蓝移，且J10组（分别在两步酶解的过程中施加300 W、10 min超声）蓝移的程度最大，从未超声组的3256.70 cm-1蓝移至3 281.78 cm-1。从图2可以看出，超声主要影响酰胺A带的出峰位置，随着超声功率的增加其出峰位置先蓝移后红移，即低功率超声（小于300 W）可以破坏氢键的形成，使底物蛋白结构更加松散，而进一步提高超声功率（大于300 W）底物蛋白之间又会相互作用重新形成聚集体。

2.1.2 超声对底物蛋白紫外光谱的影响

超声对底物蛋白紫外光谱的影响如图3所示，超声辅助碱性蛋白酶酶解组的紫外吸收峰的吸光值呈现先上升后下降的变化趋势（图3a），在低功率超声（小于300 W）的条件下，空化作用可以使埋藏在底物蛋白内部的疏水基团（例如酰胺基、酯基、烃基）暴露出来，这些疏水基团可能来源于明胶中的疏水性氨基酸侧链，例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸等[25]，但当超声功率过大时（大于300 W），这些已暴露的疏水基团之间会发生相互作用形成聚集体，使疏水氨基酸侧链被掩埋。此外，超声辅助分步酶解组的紫外吸收峰的吸光值均高于未超声组（图3b），即适当强度的超声（300 W、20 min）可以使底物蛋白的结构更为舒展，使之更利于酶解反应的进行。

a. 超声辅助碱性蛋白酶酶解过程a. Process of ultrasound-assisted alkaline proteinase hydrolysisb. 超声辅助分步酶解过程b. Process of ultrasound-assisted stepwise enzymatic hydrolysis

2.1.3 超声对底物蛋白内源荧光光谱的影响

通过蛋白质内源荧光光谱的测定可反映蛋白质空间构象的变化以及蛋白质之间的相互作用[26]。胶原中不含色氨酸，只含苯丙氨酸和酪氨酸，故荧光光谱主要表现为酪氨酸的特征，其最大发射波长在303 nm处附近[27]。从图4中可以看出超声辅助碱性蛋白酶/分步酶解组无论超声与否，其最大发射波长均在309 nm附近的荧光强度发生了变化，超声辅助碱性蛋白酶组的内源荧光特征峰的荧光强度随着超声条件的变化先上升后下降，当超声功率为300 W时，荧光峰的荧光强度达到最大值。对于超声辅助分步酶解组，当超声方式为J10时（在两步酶解过程中各施加300 W、10 min超声）内源荧光特征峰的荧光强度最大。荧光强度的大小与蛋白质的疏水性氨基酸和疏水基团有关，超声后底物蛋白荧光强度的增强可能是因为在超声的作用下更多的酪氨酸暴露所致，当超声功率过大时（大于300 W），已经展开的底物蛋白分子又会重新聚集，酪氨酸被掩埋，故内源荧光强度会降低。同时从图4中可以看出超声辅助分步酶解组的荧光强度总体而言要大于超声辅助碱性蛋白酶酶解组，这可能是在分步酶解时，超声分布于酶解的各个不同阶段，经过热水浸提之后底物蛋白已有部分展开，此时再施加超声，可能更有利于底物蛋白结构的进一步展开。

2.1.4 超声对底物蛋白圆二色谱的影响

190～250 nm的远紫外区圆二吸收可以反映出蛋白质的主链结构，220 nm处正吸收峰和197 nm处负吸收峰是胶原的特征吸收峰[28]。超声对底物蛋白圆二色谱的影响如图5a和图5b所示，所有的超声辅助碱性蛋白酶/分步酶解组均在198 nm左右出现了一个负吸收峰，且不存在正吸收峰，这说明此时超声以及热水的作用已将胶原的三股螺旋结构破坏。对于超声辅助碱性蛋白酶酶解组，随着超声功率的增加，198 nm处的吸收峰的强度呈现先增强后减弱的趋势，但与未超声组相比，超声组的吸收峰强度均大于未超声组。对于超声辅助分步酶解组，与未超声组相比，超声组的吸收峰强度均大于未超声组，当超声时间分布方式为J10时（在两步酶解的过程中各施加300 W、10 min超声），198 nm处的吸收峰最大。从图5中的变化规律可以看出，当施加小于300 W的超声时可以破坏底物蛋白分子间作用力，破坏其结构，使之更利于酶解，当超声功率大于300 W时，超声组的负吸收峰强度略高于未超声组，但是低于超声功率为300 W的处理组，这可能是因为在超声的作用下疏水基团暴露过多，这些疏水基团之间会发生相互作用形成聚集体，不利于酶解的进行[29]。

a. 超声辅助碱性蛋白酶酶解过程a. Process of ultrasound-assisted alkaline proteinase hydrolysisb. 超声辅助分步酶解过程b. Process of ultrasound-assisted stepwise enzymatic hydrolysis

氢键是维持二级结构的主要作用力，一般来说，-螺旋主要通过羰基氧（-CO）和亚氨基（NH-）之间的分子内氢键得到，而-折叠是通过多肽链之间的链间氢键稳定，-转角是由弱氢键结构产生，无规卷曲是由未折叠构象引起，与蛋白质的柔韧性有关[30]。超声对底物蛋白二级结构比例的影响如图5c和图5d所示，对于超声辅助碱性蛋白酶酶解组（图5c），经过300 W的超声处理后，-折叠含量达到最小值为35.6%，同时-转角和无规卷曲的含量达到最大值，分别为15.1%和49.3%，通常，-折叠占比越小，-转角和无规卷曲占比越大表明维持底物蛋白分子结构的氢键作用越弱，在超声功率为300 W时，底物蛋白分子中的氢键被破坏，蛋白结构逐渐舒展，有利于酶解的进行。同理，在超声辅助分步酶解组中（图 5d），-折叠的含量在J10组时达到最小值为37.7%，而-转角和无规卷曲的含量在J10组时达到最大值，分别为14.6%和47.7%，这表明J10组的超声时间分布方式可以使底物蛋白结构最大程度被破坏，更有利于酶解的进行。这种二级结构比例的变化表明适度的超声可以破坏部分氢键结构使底物蛋白结构在超声波的作用下展开，更利于酶解；而在较强的超声作用下，疏水基诱导的聚集减小了相邻蛋白质之间的距离，从而增加了强氢键结构的数量和强度，不利于底物蛋白的酶解[29]。

a. 超声辅助碱性蛋白酶酶解过程底物蛋白的圆二色性a. Circular dichroism of substrate protein during ultrasound-assisted alkaline proteinase hydrolysis b. 超声辅助分步酶解过程底物蛋白的圆二色性 b. Circular dichroism of substrate protein ultrasound-assisted stepwise enzymatic hydrolysis c. 超声辅助碱性蛋白酶酶解过程底物蛋白的二级结构占比c. Secondary structure ratio of substrate protein ultrasound-assisted alkaline proteinase hydrolysis d. 超声辅助分步酶解过程底物蛋白的二级结构占比d. Secondary structure ratio of substrate protein ultrasound-assisted stepwise enzymatic hydrolysis

注：不同字母表示同一指标中不同处理之间的显著差异（<0.05）。

Note: Different letters indicate significant differences between different treatments in the same indicator (< 0.05).

图5 超声对底物蛋白圆二色谱和二级结构比例的影响

Fig.5 Effects of ultrasound on the circular dichroism spectrum and the secondary structure ratio of substrate protein

2.1.5 超声对底物蛋白表面疏水性的影响

蛋白质的疏水性可反映蛋白质三级结构的变化，ANS荧光探针法可有效评价蛋白质表面疏水性[31]。由图 6可知对于超声辅助碱性蛋白酶酶解组的表面疏水性，随着超声功率增加，呈现先上升后下降的趋势，当超声功率为300 W时，达到最大值788.76；对于超声辅助分步酶解组的表面疏水性，可以看出超声后底物蛋白的表面疏水性均高于未超声组，当超声方式为J10时（分别在两步酶解过程中施加300 W、10 min超声），其表面疏水性达到最大值981.46。蛋白质的表面疏水性与蛋白质的结构息息相关，当蛋白质结构松散时，内部的疏水基团外翻，肽链表面的非极性氨基酸增加，表面疏水性就会随之上升，故适当的超声功率（300 W、20 min）可以使蛋白质的结构更加松散，内部疏水基团外翻。当超声功率过大时（大于300 W），蛋白质又会聚集形成较大的聚集体，使已展开的结构重新聚集，暴露的疏水基团被重新掩埋[32]。同时从图中可以看出超声辅助分步酶解组的表面疏水性总体而言要大于超声辅助碱性蛋白酶酶解组，这可能是超声辅助分步酶解时，超声分布于酶解的各个不同阶段，经过热水浸提之后蛋白质分子已有部分展开，此时再施加超声，可能更有利于蛋白质分子结构的进一步展开。

2.1.6 超声对底物蛋白粒径的影响

蛋白质的粒径也是影响蛋白质功能特性和蛋白质构象变化的主要因素[33]。不同的超声条件对底物蛋白纳米粒径影响如图7所示。超声条件不同，底物蛋白粒径的大小存在差异。对于超声辅助碱性蛋白酶酶解组，随着超声功率的变化，粒径先减小后增大，当超声功率为300 W时，粒径达到最小值291.47 nm；对于超声辅助分步酶解组，超声组的粒径均小于未超声组，当超声方式为J10时（在两步酶解过程中各施加300 W、10 min超声），底物蛋白粒径达到最小值为242.47 nm，即经过适当的超声处理后（300 W、20 min），底物蛋白的粒径会变小，有利于酶的进一步作用。粒径的降低可能与蛋白质分子间的相互作用力（氢键、疏水相互作用和静电相互作用）被超声所产生的微射流以及剪切力所破坏有关[29]，超声功率过大时（大于300 W），底物蛋白又会进一步聚集，粒径上升。Hao等[34]在研究超声时间对大豆分离蛋白粒径的影响时，也得到类似结论，即蛋白质粒径的增加可能是高功率的超声导致蛋白质重新形成聚集体所致。

a. 超声辅助碱性蛋白酶酶解过程a. Process of ultrasound-assisted alkaline proteinase hydrolysisb. 超声辅助分步酶解过程b. Process of ultrasound-assisted stepwise enzymatic hydrolysis

注：不同小写字母表示组内存在显著性差异（<0.05），下同。

Note: Different lowercase letters represent significance differences within the groups (< 0.05), the same below.

图6 超声对底物蛋白的表面疏水性的影响

Fig.6 Effects of ultrasound on the surface hydrophobicity of substrate protein

a. 超声辅助碱性蛋白酶酶解过程a. Process of ultrasound-assisted alkaline proteinase hydrolysisb. 超声辅助分步酶解过程b. Process of ultrasound-assisted stepwise enzymatic hydrolysis

2.2 超声对蛋白酶酶解能力的影响

一般认为超声的机械能和空化作用使酶分子的物理结构发生改变是超声影响酶解能力的主要原因[35]。不同的超声条件对蛋白酶酶解能力的影响如图8a和8b所示，随着超声功率的增加，超声辅助碱性蛋白酶酶解组的酶解能力呈现先上升后下降的变化趋势，从2.35×105U/g（未超声组）提高至3.44×105U/g（300 W），且差异显著（<0.05）。在不同功率诱导酶变性过程中，低强度的超声（小于300 W）改变酶分子的结构形成中间体，进而表现出较高的酶解能力[36]，而高强度的超声（大于300 W）破坏酶的空间结构，使酶分子三级结构中的各种次级键断裂，进而降低其酶解能力[12]。因此，当超声功率为300 W时，酶解能力最大（3.44×105U/g），显著高于其他组别（<0.05）。在超声辅助分步酶解组中，蛋白酶的酶解能力从3.41×105U/g（传统分步酶解组）提高至3.86×105U/g（J10组别：在两步酶解过程各中施加300 W、10 min超声），在J10组达到最高的酶活，显著高于其他组别（<0.05）。这是由于超声处理可以改变酶分子结构，使酶表现出更高的酶解能力，即适当的超声条件（300 W、20 min）可以提高酶解能力，而当超声强度过大时（大于300 W），酶解能力则又会降低。此外，超声辅助分步酶解组的酶解能力整体而言高于超声辅助碱性蛋白酶酶解组，这是因为在两种酶的作用下，酶解能力会进一步提高。

由图8c可知，经过不同超声功率诱导的碱性蛋白酶去折叠的荧光相图由3条直线组成，交点出现在3和4附近，表明在超声功率为300 W和400 W时出现了稳定的折叠中间体（中间体1和中间体2）。结合图 8c，可以明显观察到，中间体1和2所对应的酶活性较其他几组高，分别为3.44×105和3.29×105U/g，这表明在超声过程中碱性蛋白酶出现了稳定的中间体。由此可见，超声对于反应体系而言，既可以改变底物蛋白的结构，又可以改变酶分子的结构。而且适度超声处理可以有效地展开底物蛋白使之更易于被酶进攻，同时又可以一定程度通过改变酶分子的中间构象使之催化活性提升。

a. 超声辅助碱性蛋白酶酶解过程a. Process of ultrasound-assisted alkaline proteinase hydrolysisb. 超声辅助分步酶解过程 b. Process of ultrasound-assisted stepwise enzymatic hydrolysisc. 不同超声功率辅助碱性蛋白酶的去折叠荧光相图c. Unfolded fluorescence phase diagram of alkaline proteinase assisted with different ultrasonic powers

注：365：荧光发射光谱365 nm的荧光强度；320：荧光发射光谱320 nm的荧光强度。

Note:365: Fluorescence emission spectrum 365 nm fluorescence intensity;320: Fluorescence emission spectrum 320 nm fluorescence intensity.

图8 超声对蛋白酶酶解能力的影响

Fig.8 Effects of ultrasound on the enzymatic hydrolysis capacity of protease

2.3 超声辅助酶解进程的动力学分析

2.3.1 不同超声处理对酶解进程的影响

基于超声对底物蛋白理化特性和蛋白酶酶解能力的影响的分析结果，从碱性蛋白酶酶解组中优选出300 W、20 min的超声处理，在分步酶解组中优选出J10组（分别在两步酶解过程中施加300 W、10 min超声）的超声处理，探索超声辅助酶解过程中不同超声处理后的水解度随时间的变化规律，如图9所示。可以看出对于超声辅助碱性蛋白酶酶解过程（300 W、20 min），随着水解时间的变化，水解度的变化速率会逐渐趋于平缓，在酶解的240 min过程中，水解度的变化速率发生了两次陡增，分别在0～30 min和60～90 min这两个时间段。对于超声辅助分步酶解（J10组别：在两步酶解过程中各施加300 W、10 min超声），随着水解时间的变化，水解度的变化速率也逐渐趋于平缓，与超声辅助单酶酶解的过程相似，在分步酶解的过程中，水解度的变化速率也发生了两次陡增，分别在0～30 min和180～210 min。无论是超声辅助碱性蛋白酶酶解还是超声辅助分步酶解，水解度的陡增均发生在施加超声的时段。

2.3.2 超声辅助酶解进程的动力学拟合

a. 施加300 W、20 min的超声辅助碱性蛋白酶酶解过程a. Process of ultrasound-assisted alkaline proteinase hydrolysis with 300 W、20 minb. 两步酶解过程中各施加300 W、10 min超声b. Ultrasound of two steps of enzymatic hydrolysis each with 300 W and 10 min

a. 施加300 W、20 min的超声辅助碱性蛋白酶酶解过程a. Process of ultrasound-assisted alkaline proteinase hydrolysis with 300 W、20 minb. 两步酶解过程中各施加300 W、10 min超声b. Ultrasound of two steps of enzymatic hydrolysis each with 300 W and 10 min

3 结 论

1）本研究分别考察了超声对底物蛋白结构、酶和酶解过程的影响，初步探究了超声加快酶解进程的内在原因。从傅里叶变换红外光谱、圆二色谱、紫外光谱、内源荧光光谱、表面疏水性、粒径均可以看出，适当强度的超声可破坏底物蛋白结构，更利于酶解进行。当超声强度过大时，游离的蛋白质颗粒可能会重新聚集形成较大的聚集体，不利于酶解进行。

2）超声可以通过影响蛋白酶的酶解能力进而影响酶解进程。在适当超声强度下（300 W、20 min）超声辅助碱性蛋白酶酶解组最大酶解能力可达3.44×105U/g，超声辅助分步酶解组最大酶解能力可达3.86×105U/g，均显著高于未超声组（<0.05），即适当的超声强度可以提高蛋白酶酶解能力进而加快酶解进程。在超声辅助酶解过程中，随着酶解时间的变化，水解度的变化速率会趋于平缓，且水解度的陡增一般发生在施加超声时段。对超声辅助酶解过程进行动力学拟合（r＞0.95），通过建立的动力学方程发现超声辅助分步酶解的反应进程更快。

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Analysis of the internal mechanism for ultrasound-assisted enzymatic hydrolysis for promoting the hydrolysis of grass carp scale collagen peptide

Xiong Zhe1,2, Zhao Yu1,2, Qin Zibo1,2, Wang Xibo3, Rong Jianhua1,2, Xiong Shanbai1,2,3, Hu Yang1,2,3※

(1.,,,430070,; 2.-,, 430070,; 3.,,434000,)

In order to explore the internal mechanism of the hydrolysis process of collagen peptide derived from grass carp scale (), the effects of ultrasound treatment on the structure of substrate protein (grass carp scale) and the hydrolysis ability of protease were studied by Fourier transform infrared spectra, ultraviolet spectra, circular dichroism spectra, surface hydrophobicity, endogenous fluorescence spectra, particle size and enzyme activity. On this basis, the kinetics of ultrasound-assisted enzymatic hydrolysis was fitted. First of all, Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FT-IR), Ultraviolet Spectroscopy (UV-vis), Circular Dichroism (CD), Surface Hydrophobicity (S0-ANS), endogenous fluorescence spectroscopy and particle size were all employed to investigate the effects of ultrasound on the structure of substrate protein (grass carp scale). The FT-IR results indicated that the absorption peak of the substrate protein in amide A band showed a trend of first blue-shift and then red-shift with the increase of ultrasound intensity. In the meanwhile, the intensity of negative absorption of the substrate protein at 198 nm in CD spectrum, the fluorescence intensity of the endogenous fluorescence peaks in endogenous fluorescence spectroscopy and absorbance values of absorption peaks in UV-vis were all showed a first increased and then decreased tendency with the increasing of ultrasound intensity. Moreover, with the increasing of ultrasound intensity, the surface hydrophobicity of the substrate protein was increased firstly and then decreased, and the particle size was reduced firstly and then increased. All of these results indicated that the appropriate ultrasound power (300 W, 20 min) led to the expansion of substrate protein, which made it more suitable for the subsequently enzymatic hydrolysis. However, when the ultrasound power was greater than 300 W, the substrate protein would be re-aggregated so that some of the hydrophobic groups were buried, which was not conducive to the enzymatic hydrolysis. At the same time, with the increasing of ultrasound intensity, enzymatic hydrolysis capacity of protease in single-enzyme hydrolysis group was increased firstly and then decreased. When the ultrasound treatment was conducted in 300 W for 20 min, the enzymatic hydrolysis capacity of alkaline protease was increased from 2.35×105to 3.44×105U/g. Furthermore, when the ultrasound treatment of 300 W and 10 min was applied in each step of the step-by-step enzymatic hydrolysis group, the enzymatic hydrolysis capacity was increased from 3.41×105to 3.86×105U/g. Finally, the kinetics of the ultrasound-assisted enzymatic hydrolysis process were fitted by the kinetic model, and the reaction kinetic equation was established, which further demonstrated that the ultrasound-assisted step-by-step enzymatic hydrolysis process was faster than single-enzyme hydrolysis. In summary, ultrasound treatment could speed up the enzymatic hydrolysis process by destroying the structure of the substrate protein and enhancing the enzymatic hydrolysis ability of protease, thereby improving the enzymatic hydrolysis efficiency.

ultrasound; enzymes; single enzyme hydrolysis; stepwise hydrolysis; hydrolysis process; kinetic fitting

10.11975/j.issn.1002-6819.2022.16.034

TS254.9

A

1002-6819(2022)-16-0313-09

熊喆，赵钰，秦子波，等. 超声辅助酶解促进草鱼鳞胶原肽水解进程的内在机制解析[J]. 农业工程学报，2022，38(16)：313-321.doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2022.16.034 http://www.tcsae.org

Xiong Zhe, Zhao Yu, Qin Zibo, et al. Analysis of the internal mechanism for ultrasound-assisted enzymatic hydrolysis for promoting the hydrolysis of grass carp scale collagen peptide[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2022, 38(16): 313-321. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2022.16.034 http://www.tcsae.org

2022-05-23

2022-07-13

湖北省自然科学基金项目：基于分子组装行为解析“明胶-TGase”相互作用及其对消化吸收特性的影响机制（ZRMS2022000745）；中央高校基本科研业务费专项基金资助（2662018JC019）；国家大宗淡水鱼产业技术体系项目（CARS-45-28）

熊喆，研究方向为水产品加工及副产物综合利用，生物活性肽的开发及应用。Email：2282121369@qq.com

胡杨，博士，副教授，博士生导师，研究方向为水产品加工及副产物综合利用。Email：huyang@mail.hzau.edu.cn