基于网络药理学与分子对接挖掘地锦草抗类风湿关节炎的作用机制※

刘守才 廖承谱 赵小超▲ 商 勋 丁美婷 吴 玲

地锦草为大戟科植物地锦或斑地锦的干燥全草，记载于历代版《中国药典》，具有清热解毒、凉血止血、利湿退黄的功效。现代中药药理研究[1-5]表明其具有抗菌、抗炎、镇痛、抗肿瘤、免疫调节、解毒、抗过敏、抗氧化、保肝、止血与止泻等作用，临床主要用于痢疾、上呼吸道感染、肺炎、病毒性肝炎、肾盂肾炎、肠炎、皮肤湿疹等疾病。地锦草的民间应用也较为广泛，研究小组在走访收集民间验方期间发现有2 名类风湿关节炎（Rheumatoid arthritis，RA）患者使用地锦草鲜草捣成泥外敷关节处，3～5 天换药一次，1 个月左右关节处肿胀已经全部消失，疼痛消失，行走自如。关于地锦草对RA 的作用研究暂无报道，故本研究通过网络药理学初步探讨其对RA 的作用机制，并通过分子对接模拟实验验证，为进一步深入研究开发提供参考依据。

1 方法

1.1 地锦草的活性成分及靶点的收集和筛选通过中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php）、中药分子作用机制的生物信息学分析工具（Bioinformatics Analysis Tool for Molecular mechANism of Traditional Chinese Medicine，Batman-TCM，http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/），再结合《中国知网》等文献检索进行地锦草的活性化学成分收集和靶点预测工作，设置条件为生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、类药性（drug likeness，DL）≥0.18，筛选出符合条件的活性成分。

1.2 类风湿关节炎疾病靶点预测通过基因组注释数 据 库（genome annotation database platform，GeneCard，https://auth.lifemapsc.com/）、人类孟德尔遗传 数 据 库（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM，https://www.omim.org/）、DisGeNET 数 据 库（https://ngdc.cncb.ac.cn/databasecommons/）、药物靶点数据库（Therapeutic Target Database，TTD，http://db.idrblab.net/web/），关键词“Rheumatic Arthritis”，获得疾病相关靶点基因，利用Venny 2.1.0 软件获得交集靶点。

1.3 地锦草调控网络构建利用cytoscape 3.7.1 软件将药物-疾病交集靶点进行可视化处理，构建药物-疾病-靶点网络关系图。

1.4 药物-疾病靶点蛋白间互作网络将交集靶标基因复制到String数据库（http：//stringdb.org/），以人为研究对象，设置条件为mendium confidence＞0.9，剔除游离的蛋白靶点，构建出蛋白相互作用PPI 网络。“节点”代表靶点蛋白，“边”表示有效成分与靶点之间的联系。

1.5 靶点功能和通路富集分析利用Bioconductor软件，借助clusterprofiler 包、pathview包、Dose包，通过R4.4.1 软件运行获得基因本体论及通路富集数据并可视化，进行GO功能富集和KEGG通路分析，P＜0.01为筛选阈值，取校正P值前10的条目。

1.6 分子对接通过有机小分子生物活性数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）获取小分子数据，利用openbabel 转化为mol 2 格式，使用prepare_ligand4.py脚本为小分子添加电荷，分配原子类型，均设置为半柔性键，将小分子保存为pdbqt格式，便于分子对接。PDB 蛋白结构数据库（https://www.rcsb.org/）下载蛋白受体数据，采用pymol1.7程序将受体蛋白结构中的结晶水和其他小分子删除，并添加氢原子后保存。载入autodocktool 1.5.6程序，添加电荷，分配原子类型，保存为pdbqt 格式，作为分子对接受体，采用vina 1.1.2 软件进行分子对接。对接盒子大小设置为能够恰好包含蛋白的结合位点，选取对接最佳构象作为分子对接结果，结合能评分并进行排序。结合能数值越低，表明结合越好。

2 结果

2.1 地锦草的活性成分及靶点的收集和筛选共收集到51种活性成分，经筛选获得15种有效活性成分，包含4',5-二羟基黄酮、槲皮素、鞣花酸、山奈酚、紫云英苷、谷甾醇等，其中，已有研究表明槲皮素、山奈酚对RA作用良好[6-9]。活性成分对应的作用靶点共筛选出102个。

2.2 类风湿关节炎疾病靶点预测共筛选出1184个疾病靶点，通过Venny 软件最终获得38 个共同靶点，见图1。

图1 药物-疾病靶标图

2.3 地锦草调控网络构建药物-疾病-靶点网络包含节点138 个及相互联系的边191 条，其中表现活跃的成分是槲皮素、山奈酚、4',5-二羟基黄酮。见图2。

图2 药物-疾病-靶点网络图

2.4 药物-疾病靶点蛋白间互作网络PPI网络图显示，共有67个节点及其相互联系的277条边。Degree值排名前20 位的潜在抗类风湿关节炎靶点为IL-6、ALB、CASP3、NOS3、PPARG等。见图3。

图3 药物-疾病蛋白间互作网络图（PPI）

2.5 靶点功能和通路富集分析

2.5.1 GO 功能富集分析 通过GO 富集分析，筛选出53 个分子功能条目（P＜0.05），包括DNA 结合转录因子结合、泛素蛋白连接酶结合、配体激活的转录因子活性、泛素样蛋白连接酶结合、核受体活性、核糖核酸聚合酶II 特异性脱氧核糖核酸结合转录因子结合受体配体活性、组蛋白脱乙酰酶结合、核激素受体结合等，其中多个条目均有报道与RA 关系密切[10-11]，关联度较高的20条分子功能如图4。

2.5.2 KEGG 通路富集分析 通过KEGG 通路富集分析将38 个核心靶点筛选出89 条信号通路，包括脂质与动脉粥样硬化、流体切应力与动脉粥样硬化、肿瘤坏死因子信号通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、化学致癌-受体激活、白细胞介素-17信号通路、细胞凋亡、NOD样受体信号通路等，其中多条通路均有报道与RA 关系密切[11-12]，比较关键的20 条信号通路见图5。

图5 地锦草KEGG分析及气泡图

2.6 分子对接本研究通过以上综合评比分析选择地锦草5 种主要活性成分与5 个关键抗RA 靶点蛋白进行分子对接。如表1 所示，结合能数值越低，表明结合越好。其中，4',5-二羟基黄酮与AR 关键靶点蛋白结合最优，槲皮素、山奈酚与PTGS1、AR、DPP4、HSP90AA1、RELA 关键靶点蛋白结合评分均较良好，结合能≤-9的强结合共有6组。整体结合评分均较良好，分子对接情况见图6、图7。

图6 槲皮素与5个靶点蛋白分子对接模型图

图7 山奈酚与5个靶点蛋白分子对接模型图

表1 分子对接结合能评分情况表（kcal/mol）

3 讨论

民间资料收集发现，地锦草对RA 具有明显的治疗作用，两位RA患者在使用地锦草鲜草捣泥外敷后，RA 症状明显减轻，生活能力有一定的恢复。为进一步证实其作用，本文通过网络药理学和分子对接模拟实验初步探讨地锦草对RA 的分子作用机制，结果显示其对RA有一定的治疗作用，主要与DNA结合转录因子结合、核受体活性、泛素蛋白连接酶结合、泛素样蛋白连接酶结合、RNA聚合酶II特异性脱氧核糖核酸结合转录因子结合受体配体活性、配体激活的转录因子活性等分子功能有关，涉及脂质与动脉粥样硬化、化学致癌-受体激活、流体切应力与动脉粥样硬化、肿瘤坏死因子信号通路、白细胞介素-17信号通路、细胞凋亡、糖尿病并发症中的AGE-RAGE 等众多信号通路。

目前，关于地锦草化学成分方面的研究较为广泛，数据文献统计汇总为51 种，其中槲皮素、山奈酚对RA的作用研究较为全面。槲皮素是一种黄酮醇类的天然产物，主要通过抑制血管生成、滑膜增生、炎症因子浸润、中性粒细胞胞外诱捕网生成，调节破/成骨细胞和Th17/调节性T 细胞之间的平衡发挥治疗作用，涉及TNF-α、MCP-1、IL-6、IL-1β、IL-17、IL-10、NF-κB、CXCL1、CXCL5、LTB4、TGF-β、Th17细胞、中性粒细胞以及巨噬细胞等[13-19]细胞因子。山奈酚主要通过抑制FGFR3 激酶活性、降低体内外破骨细胞分化、抑制破骨细胞标志物，如抗酒石酸酸性磷酸酶、整合素β3、MMP9等发挥抗RA作用[6]。另外山奈酚具有较强的抗炎作用，主要涉及MAPK、PKC、PI3K、IL-1、IL-8、IP-10、PGE2、IL-2、TNF-α、NF-κB、AP-1 等[20-22]因子，同时这些因子也均属于与RA 关系密切的重要因子，因此其作用可能与调节炎症因子水平有关。

RA 是一种常见的慢性多系统自身免疫性疾病，周期较长，易造成残疾，此病可发生于任何年龄段，常见于青壮年，发病率高达0.2%～0.4%，严重影响患者生活质量。其发病机制[23]主要包含：①免疫细胞感染引起炎症局部产生大量的炎性细胞、ROS、炎症因子，从而激活核因子κB、蛋白激酶B、JNK 等信号通路导致RA 形成；②刺激MMPs 促使MMP-2 的产生，导致软骨、骨骼等损伤加剧RA 的发展；③氧化应激异常；④遗传和生存环境等因素。发病过程主要涉及PGs、IL-2、IL-6、IL-8、IFN-γ、COX-2、LTs、5-LOX、AA、LTB4、TNF-α、IL-1β、ROS、MMPs、MMP-2、NF-κB、T细胞等因子、蛋白酶、细胞[24-27]。目前抗RA 药物主要包括非甾体消炎药、抗风湿药、糖皮质激素、TNF抑制剂、B 细胞耗竭剂、T 细胞阻断剂、IL-6 受体单克隆抗体、IL-1受体拮抗剂、靶向小分子抑制剂等[28]药物，均存在一定的优缺点，疗效好的价格昂贵，价格便宜的不良反应多等等，尚存在不足，因此需要医药研究者们继续深入开发挖掘，以造福人类。

综上所述，地锦草活性成分、作用靶点、RA 疾病靶点基因蛋白三者存在着诸多交集与联系，可以推断地锦草具有一定的抗RA 作用，主要与肿瘤坏死因子信号通路、细胞凋亡、化学致癌-受体激活、白细胞介素-17信号通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路等有关，可为今后进一步研究开发提供参考。