响应面法优化超声协同胃蛋白酶提取鲣鱼皮胶原蛋白的工艺研究

陈 文 娟

(漳州城市职业学院 食品工程系，福建 漳州 363000)

鲣鱼(Katsuwonus pelamis)又名炸弹鱼，是金枪鱼科、鲣鱼属鱼类，广泛分布于太平洋、印度洋和大西洋的热带和亚热带海域，是金枪鱼渔业中重要的目标鱼类之一[1-2]。鲣鱼肉质柔软、胆固醇低、蛋白质含量高、氨基酸比例合理、容易被人体吸收，是优质的食品蛋白质来源。鲣鱼不仅可以鲜食，还可以加工成咸干制品或罐头，是重要的海鲜加工品之一[3-4]。但目前鲣鱼加工过程中产生的鳞片、鱼皮等副产品通常被丢弃或制成廉价饲料，造成巨大的资源浪费，鲣鱼皮中含有大量的蛋白质，是开发水产胶原蛋白的良好原料[5]。胶原蛋白占动物体内总蛋白质含量的25%～30%，是动物结缔组织的主要成分，已广泛应用于食品、药品和化妆品等领域[6-7]。超声提取具有低污染、节能环保等优点，在生物活性物质提取方面具有良好的应用前景。酶法提取具有反应快、时间短、无污染等优点，此外，酶法对胶原蛋白的破坏力较小，可以获得的较高活性的胶原蛋白[8]。将超声提取与酶法提取进行协同作用，是提高胶原蛋白提取率的一种新型方法，史睿等[9]采用超声协同胃蛋白酶辅助对骆驼皮胶原蛋白进行提取，确定了在最优的提取工艺条件下，骆驼皮胶原蛋白的提取率可达41.99%(±1.57%)；李根等[10]为提高鲵皮胶原蛋白的提取率，采用超声协同胃蛋白酶对鲵皮胶原蛋白的提取工艺进行优化，结果表明，采用超声协同胃蛋白酶所提取的鲵皮胶原蛋白提取率可达37.36%(±2.61%)，明显高于未用超声处理鲵皮胶原蛋白的提取率17.56%(±1.77%)。目前，尚未发现有利用超声协同胃蛋白酶对鲣鱼皮胶原蛋白提取的报道，该研究以鲣鱼皮为原料，对超声协同胃蛋白酶提取胶原蛋白的工艺进行了响应面优化，确定了最佳提取工艺条件，为鲣鱼皮资源提取胶原蛋白的开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

鲣鱼，市售；胃蛋白酶(1 200 U/g)，磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、羟脯氨酸等均为市售分析纯。

1.2 仪器与设备

KQ-100DE型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；UV-1800PC-DS2型紫外可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 胶原蛋白的提取

将鲣鱼去鳞、去鳍、去头、去内脏后对剖成2片，再将鱼皮与鱼肉分离。将鱼皮剪成碎片，清水冲洗干净，阴凉处自然晾干，备用。用NaOH溶液浸泡鱼皮脱蛋白和脱色，后用正己烷去除脂肪，后加入pH值为2.0的磷酸盐缓冲溶液浸泡12 h进行匀浆，放入超声波中处理一定时间，加入适量的胃蛋白酶溶液，然后放入一定的恒温水浴锅中进行酶解提取，灭酶，冷却、离心，取上清液测定鲣鱼鱼皮胶原蛋白提取率。

1.3.2 鲣鱼皮胶原蛋白提取率的测定

利用《肉与肉制品羟脯氨酸含量测定》(GB/T 9695.23-2008)对羟脯氨酸含量进行测定，计算出鲣鱼皮胶原蛋白提取率。

(1)

式中,W为羟脯氨酸得率，%；k为稀释倍数；b为羟脯氨酸的标准液质量浓度，g/L；V为提取液体积，mL；n为换算系数(取0.1)；m1为鲣鱼皮质量，g。

最终通过下式得到鲣鱼皮胶原蛋白提取率为：

(2)

式中,X为鲣鱼皮胶原蛋白提取率，%；w为羟脯氨酸含量，g；11.1 为羟脯氨酸换算为蛋白质的系数；m2为鲣鱼皮质量，g。

1.3.3 单因素试验

以鲣鱼皮胶原蛋白提取率为指标，每次实验鲣鱼皮用量为10 g，以超声时间、酶解温度、酶解时间和酶用量4个因素进行单因素试验，固定各单因素条件在超声时间150 min，酶解温度35 ℃，酶解时间240 min，酶用量180 U/g的条件下提取胶原蛋白，分别设置考察超声时间(90、120、150、180、210 min)，酶解温度(25、30、35、40、45 ℃)、酶解时间(180、210、240、270、300 min)和加酶量(140、160、180、200、220 U/g)对胶原蛋白提取率的影响，每个水平测定3次，取均值。

1.3.4 响应面优化试验

根据单因素的最佳工艺条件，选取超声时间、酶解温度、酶解时间和酶用量4个因素进行Box-Behnken设计并进行响应面优化，具体工艺参数如表1所示。

表1 Box-Behnken设计表

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 超声时间对胶原蛋白提取率的影响

由图1可知，随着超声时间的延长胶原蛋白提取率呈现先增加后减少的趋势，在超声时间为150 min时，提取率效果最佳，说明此时胶原蛋白溶出量最好，但超过150 min后，胶原蛋白提取率反而降低，这是因为部分胶原蛋白在长期的超声处理过程中由于系统局部温度过高导致结构被破坏[11]。因此，超声波时间选择为150 min。

图1 超声时间对胶原蛋白提取率的影响

2.1.2 酶解温度对胶原蛋白提取率的影响

由图2可知，随着酶解温度的升高胶原蛋白提取率呈现先增加后减少的趋势，在酶解温度为35 ℃时，提取率效果最佳，说明此时温度为酶最适宜的活性温度，酶活力强，酶解速度快，胶原蛋白提取率高，但酶解温度超过35 ℃后，胶原蛋白提取率反而降低，这是因为胃蛋白酶不在适宜的活性温度下，容易发生钝化而活力下降[12]，因此，酶解温度选择为35 ℃。

图2 酶解温度对胶原蛋白提取率的影响

2.1.3 酶解时间对胶原蛋白提取率的影响

由图3可知，随着酶解时间的延长胶原蛋白提取率呈现先增加后减少的趋势，在酶解时间为240 min时，提取率效果最佳，说明此时酶与底物充分接触，酶解效果最佳，但酶解时间超过240 min后，胶原蛋白提取率反而降低，这是因为部分胶原蛋白在酶作用太长时间时会发生水解[13]。因此，酶解时间选择为240 min。

图3 酶解时间对胶原蛋白提取率的影响

2.1.4 酶用量对胶原蛋白提取率的影响

由图4可知，随着酶用量的增加胶原蛋白提取率呈现先增加后减少的趋势，在酶用量为180 U/g时，提取率效果最佳，说明此时酶的浓度与底物的作用效率最高，但当酶用量超过180 U/g后，胶原蛋白提取率反而降低，这是因为过量的酶浓度作用，酶会将底物包裹而减少了酶解作用[14]，因此，酶用量选择为180 U/g。

2.2 响应面优化工艺

2.2.1 回归模型

基于Box-Benhnken实验设计原理，利用Design Expert 8.05b软件进行处理，确定了以胶原蛋白提取率为响应值，超声时间(A)、酶解温度(B)、酶解时间(C)、酶用量(D)4个工艺为因素的响应面实验，实验方案及结果见表2，方差分析见表3。

图4 酶用量对胶原蛋白提取率的影响

表2 胶原蛋白提取的Box-Benhnken实验设计

根据表2的响应面实验及实验结果，再通过Design-Expert 8.05b软件进行计算，确定了超声时间(A)、酶解温度(B)、酶解时间(C)和酶用量(D)对胶原蛋白提取率(Y)的四元二次回归方程：

Y=37.88-0.54A+1.11B+1.06C+0.53D+0.74AB-0.51AC+0.01AD+0.08BC+0.24BD-0.36CD-2.03A2-2.04B2-1.86C2-1.77D2。

(3)

根据表3提取工艺的回归模型及结果，得到该回归方程F=34.09，P<0.000 1，回归方程极显著；回归模型的相关系数R2=0.971 5，说明有97%以上的响应值的变化可以用该模型来进行描述与预测。而失拟项F=3.99，P=0.097 4>0.05，不显著，说明该回归方程的预测值与实验的真实值之间具有较好的拟合度。综上分析，利用该回归模型方程来对实验结果进行分析与预测是有一定的依据，是可靠的。回归方程中一次项A、B、C、D，交互项AB、二次项A2、B2、C2、D2对胶原蛋白提取率影响极显著(P<0.01)；交互项AC对胶原蛋白提取率影响显著(P<0.05)，说明超声时间(A)、酶解温度(B)、酶解时间(C)和酶用量(D)等工艺与胶原蛋白提取率之间不是简单的线性关系。另外,从表3方差分析表中的F值及P值可以看出，各工艺对胶原蛋白提取率影响的大小顺序为：B>C>A>D，即酶解温度>酶解时间>超声时间>酶用量。

表3 提取工艺的回归模型及结果

2.2.2 响应面分析

响应面图和等高线图是反映所考察工艺及工艺间交互作用对响应值作用程度的图形，从图中可以直观地判断两两因素之间交互作用的影响程度。利用Design-Expert 8.05b软件对实验数据进行计算，绘制得到图5～6，其它影响不显著的图略。图中反映了超声时间(A)、酶解温度(B)、酶解时间(C)和酶用量(D)4个因素中，其中2个因素取零水平的情况下，剩余的其它两因素之间相互作用对胶原蛋白提取率的影响程度。从图中可以直观地看出超声时间和酶解温度交互作用的响应面图曲线最陡，等高线图呈椭圆形最厉害，说明超声时间和酶解温度的交互作用对胶原蛋白提取率的影响最为显著，同理可得，影响鲣鱼皮胶原蛋白提取率的各交互作用因素顺序为AB>AC>CD>BD>BC>AD。

图5 超声时间和酶解温度对胶原蛋白提取率的影响

图6 超声时间和酶解时间对胶原蛋白提取率的影响

2.2.3 最佳工艺及验证实验

根据Design Expert 8.05b软件对响应面实验的分析及结果，得到超声协同胃蛋白酶提取鲣鱼皮胶原蛋白的最佳工艺条件为：超声时间146.34 min、酶解温度36.32 ℃、酶解时间248.85 min、酶用量182.74 U/g，在此最佳工艺条件下，预测的胶原蛋白的提取率为38.25%。为了实验操作的简便，将最佳工艺条件修正为：超声时间146 min、酶解温度36 ℃、酶解时间249 min、酶用量183 U/g，在修正后提取工艺条件下，重复3次实验作平行验证，得到鲣鱼皮胶原蛋白提取率的平均值为38.11%，与预测提取率的相对误差为0.37%，说明该回归模型具有一定的可靠性，准确度好，因此，利用响应面对超声协同胃蛋白酶提取鲣鱼皮胶原蛋白的提取工艺进行分析与工艺指导具有一定的应用意义。

3 结论

该研究以鲣鱼皮为原料，采用超声协同胃蛋白酶提取鲣鱼皮胶原蛋白，利用单因素和响应面实验对影响提取工艺的因素进行了优化。研究表明，在单因素实验中，胶原蛋白提取率随着超声时间、酶解温度、酶解时间和酶用量4个因素水平的增加，均呈现先上升后下降的趋势；在响应面实验中，由方差分析结果可知，各工艺对胶原蛋白提取率影响的大小顺序为：酶解温度>酶解时间>超声时间>酶用量。超声协同胃蛋白酶提取鲣鱼皮胶原蛋白的最佳工艺条件为：超声时间146 min、酶解温度36 ℃、酶解时间249 min、酶用量183 U/g。在此工艺条件下，胶原蛋白的提取率为38.11%，与预测值的相对误差为0.37%，说明该回归模型具有一定的可靠性，准确度好，说明响应面法可以较好地预测超声协同胃蛋白酶提取鲣鱼皮胶原蛋白的提取率。