右美托咪定对异氟烷麻醉引起的老年小鼠认知功能障碍保护作用及机制研究

聂清华，李 飞

(咸阳市第一人民医院麻醉科,陕西 咸阳 712000)

术后认知功能障碍(Postoperative cognitive dysfunction,POCD)是一种被定义为麻醉和手术后出现的认知功能下降，主要以记忆力受损、学习困难和注意力减退为特征的轻度认知功能障碍[1-2]。POCD是老年手术患者最常见的术后并发症之一，也是麻醉、精神、老年等各专科共同关注的热点问题[3]。POCD不仅引起手术患者康复延迟，还严重影响其生活自理能力和生活质量，显著增加家庭与社会经济负担[4]。然而，目前有关 POCD 的发病机制仍不清楚，尚未开发出预防和治疗POCD发生的有效药物。因此，开发和寻找预防或治疗POCD的临床方案和药物对于降低POCD发生率和减弱POCD危害意义重大。

右美托咪定是一种相对选择性α2-肾上腺素受体激动剂，主要应用于重症监护病房患者的镇痛和镇静，被证实可有效控制重症监护病房患者谵妄症状[5-6]。右美托咪定不仅具有镇静、阿片类药物等作用，还具有抗交感、协同镇痛、抗焦虑、镇静以及较小的呼吸抑制作用[7-8]。此外，之前的研究还报道右美托咪定可以通过调控MAPK/ERK信号通路的激活而抑制麻醉药物引起的神经炎症和氧化应激，进而减少麻醉导致的神经元细胞凋亡[9-10]。相关分子机制研究提示[11]，右美托咪定具有抑制促凋亡蛋白表达的作用，这是其抑制神经炎症引起的神经元凋亡的机制之一。本研究旨在探讨右美托咪定对异氟烷麻醉后老年小鼠认知功能的影响及其分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验小鼠：45只C57BL/6J小鼠(21月龄，SPF级，雄性，28～32 g左右)斯贝福(北京)生物技术有限公司[许可证号：SCXK(京)2022-027]。所有小鼠被适应性喂养一周(自由进食饮水，昼夜各半，22 ℃)后被用于本研究。本研究所涉及动物实验部分均经我院动物伦理委员会审查通过，并监督动物实验进程。

1.1.2 试剂与仪器：吸入异氟烷(国药准字H20020267)；盐酸右美托咪定注射液(国药准字H20110085)；Bcl-2-Associated X的蛋白质(Bax)抗体(41162，CellSignalingTechnology)；B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)抗体(15071，Cell Signaling Technolog)；BeyoECL Plus (超敏ECL化学发光试剂盒，P0018S，碧云天生物技术公司)，一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(绿色荧光，C1086，碧云天生物技术公司)；徕卡激光扫描共聚焦显微镜(STELLARIS 5 Cryo，徕卡)；小动物吸入式麻醉机(R500，深圳市瑞沃德生命科技有限公司)；Morris水迷宫实验仪器(XR-XM101-Z，上海欣软信息科技有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 小鼠分组与治疗：对照组小鼠被放入麻醉箱中，麻醉箱通入氧气，维持4 h。模型组小鼠被放入麻醉箱，麻醉箱通入异氟烷和氧气，异氟烷浓度维持在1.5%，异氟烷麻醉时间共计4 h。治疗组小鼠在被放入麻醉箱前腹腔注射15 μg/kg右美托咪定，然后放在通入1.5%异氟烷和氧气的麻醉箱中，共计4 h。

1.2.2 血气分析：所有小鼠在完成麻醉暴露后，取尾静脉血离心(1000 g，室温，5 min)以分离血清，pH计测量血浆pH值。同时使用血气分析仪检测所有小鼠血氧分压(PO2)和血二氧化碳分压(PCO2)。

1.2.3 Morris水迷宫实验:所有小鼠完成异氟烷暴露后第2天进行Morris水迷宫实验以评估认知功能。定位巡航实验：小鼠被放入一个圆形装满水的池子中，池子某一个象限内放置一个平台，将小鼠从池子边缘放入，记录小鼠从入水到找到中央平台的时间，即为逃逸潜伏期。若小鼠在60 s内未能找到平台，将其引导到平台上停留15 s再次测定。每次测定间隔时间为半小时，每只小鼠每天测定4次，取其平均值，即为该小鼠当天平均逃逸潜伏期，连续测试5 d。空间探索实验：定位巡航实验结束第2天，撤除平台，将小鼠放入平台放置象限的对向平台，记录2 min内小鼠在平台放置象限的活动时间和跨越平台的次数。

1.2.4 矿场实验:Morris水迷宫实验结束第2天进行矿场实验。矿场实验使用一个圆形封闭装置，该装置自底部被分为25个格子，中央为中央格，自中央格放入小鼠，观察120 s内穿越的格子数(3只脚进入其他小方格)、后腿(两前腿同时离地面)直立次数以及在中央格停留时间。

1.2.5 神经元凋亡检测:小鼠在完成所有认知行为学检测后，通过颈椎脱臼法被处死，分离小鼠脑组织海马区，4%多聚甲醛室温固定过夜，经石蜡包埋后制作5 μm的组织切片，使用一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒对小鼠海马区组织进行染色，在共聚焦显微镜下计数每个视野绿色荧光细胞数目(凋亡神经元)，每只小鼠共选择10个视野计数凋亡神经元数目，取平均值即为该小鼠海马区神经元凋亡数目。

1.2.6 Bax和Bcl-2蛋白表达:小鼠在完成所有认知行为学检测后，通过颈椎脱臼法被处死，分离小鼠脑组织海马区，加入组织裂解液裂解组织，离心以收集裂解液上清，并使用BCA试剂盒测定组织裂解液中总蛋白浓度。使用10%聚丙烯酰胺凝胶电泳胶进行分离细胞裂解总蛋白，然后将蛋白通过电泳法转移至硝酸纤维素膜上。室温下，使用5%的脱脂奶粉封闭硝酸纤维素膜1 h。PBS溶液洗涤3遍后，随后与抗Bax和Bcl-2抗体一起在4 ℃条件下孵育过夜。PBS冲溶液洗涤3遍后，加入山羊抗兔或山羊抗鼠的二抗室温孵育1 h。最后，使用增强的化学发光仪器拍照检测蛋白印迹。

2 结 果

2.1 三组小鼠血气分析结果比较 三组小鼠在麻醉过程中均未出现呼吸抑制，血浆pH值均在正常范围内波动，组间比较无统计学差异(均P>0.05)；三组小鼠在麻醉期间均未出现缺氧现象，三组间小鼠PO2和PCO2比较均无统计学差异(均P>0.05)。见表1。

表1 三组小鼠血气分析结果比较

2.2 三组小鼠Morris水迷宫实验结果比较 三组小鼠在定位巡航实验的第1～5天，平均逃逸潜伏期逐渐缩短，但模型组小鼠每天平均逃逸潜伏期均显著长于对照组小鼠和治疗组小鼠(均P<0.05)，见表2。此外，在定速巡航实验结束后，三组小鼠均进行空间探索实验，结果显示：模型组小鼠在目的象限活动时间均显著低于对照组小鼠和治疗组小鼠，并且模型组小鼠穿越平台次数均低于对照组小鼠和治疗组小鼠(均P<0.05)，见表3。

表2 三组小鼠定位巡航实验逃逸潜伏期比较(s)

表3 三组小鼠空间探索实验结果比较

2.3 三组小鼠矿场实验结果比较 三组小鼠分别在完成Morris水迷宫第2天进行矿场实验，结果显示：模型组在中央格停留时间均显著高于对照组和治疗组，而模型组跨格次数和直立次数均显著低于对照组和治疗组(均P<0.05)。见表4。

表4 三组小鼠矿场实验结果比较

2.4 三组小鼠海马区神经元凋亡数目及凋亡相关蛋白表达比较 模型组小鼠海马区神经元凋亡数目均显著高于对照组和治疗组小鼠(均P<0.05)；模型组小鼠海马区Bax蛋白表达水平均显著高于对照组和治疗组小鼠，而Bcl-2蛋白表达水平均显著低于对照组和治疗组小鼠(均P<0.05)。见表5。

表5 三组小鼠海马区神经元凋亡数目和凋亡相关蛋白含量比较

3 讨 论

术后认知功能障碍是围术期最常见的严重并发症之一，出现POCD的患者临床症状包括混乱、焦虑、性格改变和记忆力受损[1]。重要的是，术后认知功能障碍还与手术患者病死率增加、住院时间延长、术后并发症增加和短期生活质量下降有关[3-4]。高龄是POCD的主要危险因素之一，这主要是由于高龄患者自身调节功能受损，身体和心理功能有所减退，对麻醉和手术等事件的应激能力也有所下降；高龄同时伴随着药代动力学和药效学的变化、肾和肝清除能力下降、药物清除半衰期延长和药物敏感性的改变[3,12]。此外，老年人常合并多种基础疾病或损害，如心血管疾病、糖尿病和肝肾功能不全等，这些因素均增加了围术期POCD的风险[12]。近年来，随着我国老龄化进程的进一步深入，外科手术中老年患者所占的比例越来越大。而流行病学数据也显示[13-14]，年龄是POCD发生的独立危险因素，在大、中型非心脏手术中，65岁以上患者POCD的发生率高达40%，而在心脏手术中，该比例可高达60%。因此，研究老年患者POCD发生的分子机制，寻找可预防或治疗老年POCD的新药物或新的治疗方案对减少老年患者POCD发生率，减低POCD对老年患者的危害意义重大。

本研究将老年小鼠暴露于异氟烷中以建立麻醉诱导的老年小鼠认知功能障碍模型，结果显示：模型组老年小鼠血气分析各项指标均与对照组小鼠比较无统计学差异，但每天平均逃逸潜伏期和中央格停留均时间较对照组显著增加，并且模型组小鼠在空间探索实验中的穿越平台次数，在矿场实验中跨格次数和直立次数均显著减少，这表明异氟烷暴露诱导老年小鼠认知功能障碍模型建立成功。这一结果与Cao等[15]的研究结果一致，Cao等[15]研究发现异氟烷暴露可显著损害老年老鼠认知功能障碍。进一步分析可知[16]，异氟烷是一种常被用于手术术前麻醉和术中麻醉维持的吸入性麻醉药物，由于其麻醉诱导和复苏均较快，麻醉时无交感神经系统兴奋现象等诸多优势而常常被用于老年患者手术麻醉。因此，本研究使用异氟烷暴露建立麻醉诱导的老年小鼠认知功能障碍模型更贴近于临床实际。

此外，本研究还发现，经右美托咪定治疗的治疗组小鼠定位巡航实验中每天平均逃逸潜伏期和矿场实验中中央格停留时间均较模型组显著降低，而治疗组小鼠平台穿越次数、跨格次数和直立次数均显著升高，表明提前腹腔注射右美托咪定治疗可显著改善异氟烷麻醉引起的老年小鼠认知功能障碍。这与屈献锋等[17]的研究结果一致，屈献锋等[17]研究发现，右美托咪定可显著降低七氟烷麻醉小鼠逃逸潜伏期和中央格停留时间，提高穿越平台次数、跨格次数和直立次数。与本次研究所不同的是屈献锋等[17]研究所建立的麻醉诱导的老年小鼠认知功能障碍模型所使用的药物是七氟烷，而本次研究所使用的麻醉药物是异氟烷；相比较于七氟烷，异氟烷在老年患者麻醉诱导和麻醉维持中的应用更加广泛。进一步分析可知[5-8]，右美托咪定作为强α2-肾上腺素能激动剂，具有一系列可能对术后有益的作用，包括右美托咪定通过下丘脑-垂体-肾上腺轴调节全身应激反应而在动物模型中的神经保护作用。此外，临床研究也发现[18]，术中输注右美托咪定可有效降低重大非心脏手术老年患者术后谵妄和认知功能障碍的发生率。结合本研究结果表明，右美托咪定对麻醉引起的老年患者术后认知功能障碍具有预防作用。

进一步的分子机制研究发现，右美托咪定治疗可通过抑制小鼠海马区Bax蛋白表达和促进Bcl-2蛋白表达而减少异氟烷暴露引起的海马区神经元凋亡，这与Zhang[19]和Zhu等[20]的研究结果一致。Zhang等[19]研究发现，异氟烷可诱导神经细胞死亡并通过损伤线粒体来损坏学习与记忆，是引起老年患者POCD发生的诱因之一；而Zhu等[20]的研究表明，右美托咪定通过靶向 miR-155 介导 ERK1/2 信号通路抑制Bax蛋白表达和促进Bcl-2蛋白表达而减少氧葡萄糖剥夺/复氧引起大鼠海马神经元的凋亡。结果表明，右美托咪定通过抑制Bax、促进Bcl-2蛋白表达而减弱外界不良刺激引起的老鼠神经元凋亡。

综上所述，右美托咪定可显著改善异氟烷麻醉引起的老年小鼠认知功能障碍，其机制与通过Bax/Bcl-2轴调控的小鼠海马区神经元凋亡有关。