miR-208基因rs8022522和rs12894524位点多态性在广西人群的分布

刘 潮 ,罗艳萍 ,谷嬉嬉 ,陈健明 ,蓝 艳 ,韦叶生

(1.桂林医学院附属医院检验科,广西桂林 541000;2.右江民族医学院附属医院皮肤科,广西百色 533000)

miRNA 是一类长度为20～25个核苷酸的内源性非编码小分子RNA,通过与靶m RNA 的3'-UTR区特异性结合,从而降解靶m RNA 或者抑制其表达。miRNA 还参与调控细胞增殖、分化与凋亡等多种生物学过程,在机体正常发育、新陈代谢及疾病发生发展等过程中发挥着重要作用[1-2]。miR-208基因作为目前临床心脑血管疾病研究广泛的miRNA 之一,其主要机制包括miR-208a可以通过与靶基因活化蛋白C、细胞程序性死亡蛋白结合,加重心肌细胞凋亡、氧化损伤和自噬[3],降低miR-208b-3p表达能够减轻缺血再灌注损伤心肌细胞氧化应激损伤、炎症反应,从而抑制心肌细胞凋亡、自噬[4];除了参与体内众多复杂过程的调控外,miR-208基因还被证明在短暂性脑缺血发作、心肌梗死[5]和冠心病[6]等多种心脑血管疾病中异常表达,并通过调控机制使这些疾病朝着不同的方向改变。血脂异常是上述多种心脑血管疾病的独立危险因素,早期发现和血脂控制是避免心脑血管疾病发生的重要手段。已有多位学者对不同人群血脂水平与相关基因的单核苷酸多态性(SNP)进行研究,而关于miR-208 基因rs8022522 和rs12894524位点单核苷酸多态性的研究在国内外尚未查阅到有关的文献报道。因此,本研究对广西健康人群miR-208基因rs8022522和rs12894524位点采用高通量SNPscan技术进行基因分型检测,以探究其在不同种族健康人群中的分布特征,并进一步分析两位点基因多态性与血脂指标的相关性,为今后对miR-208基因在相关疾病进程中的机制研究提供新思路,为群体遗传学在地区的研究提供参考资料,丰富广西人群基因数据库。

1 对象与方法

1.1 研究对象

随机选取2020年6月至2021年6月来桂林医学院附属医院体检的无亲缘关系的体检人群297例,其中女性127例,男性170例,年龄21～79岁,排除患有重大疾病如血液性疾病、肿瘤感染、心脑血管疾病及癌症等。本研究通过本院伦理委员会审批。

1.2 位点选择依据

①通过NCBI网站查找miR-208a/b基因多态性情况,尽量选取标签SNP(tagSNP);②已经被1000基因组计划(1000 Genomes Project)扫描过的位点;③亚洲人群中次要等位基因频率大于5%的位点,即MAF＞0.05;经过筛选,最终miR-208a基因rs8022522、miR-208b基因rs12894524被用于进一步研究。

1.3 临床样本的采集及处理

抽取研究对象晨起静脉血3 mL于EDTA-K2抗凝采血管中,用于全血基因组DNA 提取;另外,采集入组研究对象晨起空腹静脉血4 mL于生化管中,用于血脂生化指标的检测。放入-80℃冰箱保存备用。

1.4 基因组DNA提取

采用EDTA-K2 抗凝管收集各体检者静脉血3.0 mL,血液基因组DNA 提取试剂盒(吸附柱法)购自北京天根生化科技有限公司,并按照其说明书方法提取基因组DNA,将提取的DNA 放置-80℃冰箱分装储存。选取DNA 样本浓度在20～50 ng/μL 范围之间、OD260/280值在1.7～2.0范围之间的合格样本用于后续基因分型实验。

1.5 引物的设计与合成

登 录NCBI 查 询miR-208 基 因rs8022522 和rs12894524 的DNA 序列,引物序列的设计采用Premier 3.0在线软件进行设计,将设计好的引物序列交给上海天昊公司公司合成。引物序列如下。

rs8022522:上游AGCTCATGCACATTCTTTCCTC,下游GCACCGGCTACAGAATGAGATA

rs12894524:上游CCTGTCATGGTTTACTGTTTGCTG,下游GAAGGAGGAGAGAAAATGAACTAGG。

1.6 连接和多重荧光PCR反应及基因分型检测

①连接反应:反应体系总体积均为20.0μL,其中包括2.0μL 1×GC 缓冲液I、2.5 mmol Mg2+、0.2 mmol d NTP、0.2μL 引 物、1.0 U HotStarTaq聚合酶和1μL模板DNA,剩余体积用灭菌双蒸水补足。连接反应参数如下,94℃1 min,58℃4 h,循环4次,94℃2 min,72℃forever。②多重荧光PCR扩增:反应体系总体积20μL,其中包括上述连接产物1.0μL,2×PCR 缓冲液A 10.0μL,TaqDNA 聚合酶0.4μL,多重荧光扩增引物0.5μL,灭菌双蒸水8.1μL。多重荧光PCR 反应参数如下,96℃1 min,94℃20 s,60℃40 s(每个循环降低0.5℃),72℃2 min,循环9次;94℃20 s,57℃40 s,72℃1.5 min,循环25次;68℃60 min;4℃forever。③基因分型:将上述得到的产物经dd H2O稀释10倍并振荡混匀后,取1.0μL该混合液与0.5μL Liz500SIZESTANDARD,8.5μL Hi-Di混匀,95℃变性5 min后在ABI3730XL测序仪上检测,Polyphred软件分析原始数据。

1.7 血脂相关指标检测

采集各受试者空腹12 h静脉血4 mL,以3 000 r/min离心10 min,分离血清,用全自动生化分析仪检测血清总胆固醇(total cholesterol,TC)、三酰甘油(Triglycerides,TG)、高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)。

1.8 统计学分析

将所得到的实验结果用SPSS 20.0软件进行统计分析。其中,采用直接计数法统计两位点的基因型和等位基因频率的分布,之后用SPSS 20.0软件对两位点的基因型和等位基因频率的分布用χ2检验来分析,对符合正态分布的血脂等计量资料采用t检验,均值±标准差()表示,P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-208基因rs8022522和rs12894524研究对象的一般临床资料

参与研究的对象一共297名。临床资料见表1。

表1 研究对象临床资料Tab.1 Clinical data of the research subjects

2.2 miR-208基因rs8022522和rs12894524两位点基因分型检测结果

分型结果显示,rs8022522存在AA(2.7%)、AG(24.2%)及GG(73.1%)3种基因型,等位基因A、G频率分别为14.8%、85.2%。rs12894524 位点存在TT(1.3%)、TG(13.5%)以及GG(85.2%)3种基因型,等位基因T、G 频率为8.1%、91.9%。基因分型结果见图1、图2。

图1 miR-208基因rs8022522位点测序图Fig.1 The sequencing map of miR-208 gene rs8022522

图2 miR-208基因rs 12894524位点测序图Fig.2 The sequencing map of miR-208 gene rs12894524

2.3 广西健康人群miR-208 基因rs8022522 和rs12894524位点多态性的分布情况

在广西健康人群miR-208 基因rs8022522 和rs12894524位点中,常见的基因型分别为GG(73.1%)和GG(85.2%),其次为AG(24.2%)和GT(13.5%);其中,频率最高的等位基因分别为G(85.2%)和G(91.9%)。通过比较两位点的基因型和等位基因频率在男女性别间的分布发现差异无统计学意义(P＞0.05,表2)。

表2 广西健康人群miRNA-208基因rs8022522和rs12894524基因型和等位基因频率分布Tab.2 Distribution of genotype and allele frequencies of miRNA-208 gene between rs8022522 and rs12894524 in Guangxi population

2.4 广西健康人群miR-208基因rs8022522和rs12894524两位点多态性与不同种族人群间的比较

将广西健康人群rs8022522、rs12894524两位点基因型和等位基因频率与Hap Map公布的Hap Map-CEU、Hap Map-YRI及Hap Map-TSI基因多态性数据进行比较(Hap Map 群体数据来自以下网站:http://asia.ensembl.org/index.html),结果显示三者差异均有统计学意义(P＜0.05);而将结果与Hap-Map-JPT、Hap Map-CHB 相 比,rs8022522、rs12894524基因型和等位基因频率两者差异均无统计学意义(P＞0.05,表3,表4)。

表3 广西健康人群miR-208基因rs8022522基因型和等位基因频率与不同人群的比较Tab.3 Comparison of genotype and allele frequencies of miR-208 gene rs8022522 polymorphism in Guangxi population and other regional groups

表4 广西健康人群miR-208基因rs12894524基因型和等位基因频率与不同人群的比较Tab.4 Comparison of genotype and allele frequencies of miR-208 gene rs12894524 polymorphism in Guangxi population and other regional groups

2.5 miR-208基因rs8022522和rs12894524两位点不同基因型血脂水平比较

广西人群rs12894524位点TT、TG、GG基因型携带者之间各血脂指标差异均无统计学意义(P＞0.05);rs8022522位点AA、AG、GG基因型携带者之间,TG、TC和LDL-C比较,差异没有统计学意义(P＞0.05);GG组与AG组HDL-C比较,差异有统计学意义(P＜0.05),GG 组HDL-C水平较AG 组高(表5,表6)。

表5 广西人群miR-208基因rs8022522位点不同基因型血脂水平比较Tab.5 Comparison of lipid indexes among genotypes of rs8022522 in miRNA-208 gene (mmol/L,)

表5 广西人群miR-208基因rs8022522位点不同基因型血脂水平比较Tab.5 Comparison of lipid indexes among genotypes of rs8022522 in miRNA-208 gene (mmol/L,)

与GG 比较,*P＜0.05。

表6 广西人群miR-208基因rs12894524位点不同基因型血脂水平比较Tab.6 Comparison of lipid indexes among genotypes of rs12894524 in miRNA-208 gene (mmol/L,)

表6 广西人群miR-208基因rs12894524位点不同基因型血脂水平比较Tab.6 Comparison of lipid indexes among genotypes of rs12894524 in miRNA-208 gene (mmol/L,)

3 讨 论

miR-208基因作为临床研究广泛的miRNA 之一,位于人类第14号染色体上。本研究将miR-208基因两位点多态性与Hap Map公布的5个人群基因多态性数据比较发现,两位点的基因型和等位基因频率同Hap Map-CEU、Hap Map-YRI及Hap Map-TSI相比有统计学差异,与Hap Map-CHB相比无统计学差异。可能是因为广西人群与Hap Map-CHB 和Hap Map-JPT 人群所处地区同属于亚洲地区,与Hap Map-CEU 等相比地缘关系相对较近,因此,两位点的遗传多态性分布差异相对较小,与遗传学定律中所描述的“亲缘关系越近,其基因型的分布越相似,反之则差异越显著[7]”相符。而Hap Map-CEU、Hap-Map-YIR 和Hap Map-TSI 3 种人群大多数为白种人、黑种人,广西人群为黄种人,其地缘关系、亲缘关系都相对较远,多种影响因素阻碍了种族间遗传物质的交流,久而久之,出现了各群体发生的遗传变异朝着不同的方向发展的现象,这可能是导致遗传多态性在上述5种人群中呈现出不同程度差异的原因之一。基因多态性受多种因素的影响,常见的影响因素包括地理位置、种族、生活环境、饮食习惯的不同及遗传突变等。同一SNP位点与同一疾病的遗传易感性在不同的地域、人群间也存在不同程度的差异[14],而同一SNP位点基因多态性的差异也能引起不同的疾病。例如,FRAGOSO 等[8]研究发现,miRNA-196a2 C/T(rs11614913)多态性的T 等位基因与冠状动脉疾病的风险相关,然而LI等[9]研究发现,rs11614913 基因多态性与胃癌风险升高之间有关联。本次研究结果表明,由于不同种族的遗传背景、生活方式等不同,同一SNP位点在不同种族间存在不同程度的差异。

随着人类基因组计划不断完善,越来越多的研究发现微小RNA 与肿瘤[10-11]、癌症[12-13]等多种疾病的发生发展相关。而miR-208基因在多种疾病的发生发展过程中有重要作用,例如,miR-208b-5p在非小细胞肺癌(NSCLC)中下调,miR-208b-5p 可能通过靶向IL-9/STAT3通路阻止上皮-间质转化(EMT)的激活,降低NSCLC细胞的迁移和侵袭能力[14]。因此,-208b-5p可能代表了一个通过靶向IL-9/STAT3通路来诊治非小细胞肺癌的新靶点。miR-208基因在包括动脉粥样硬化和心肌梗死在内的冠状动脉疾病中表达升高。血脂水平异常与动脉粥样硬化的发生发展密切相关[15],因此,积极控制、干预血脂水平对于以动脉粥样硬化为病理基础的疾病防治有着重大的意义。体内脂质代谢受环境、遗传以及遗传-环境等多种因素相互作用的影响,而且这种遗传变异通常存在种族特异性。人类可遗传变异中最常见是SNPs,是指在基因组的水平上由于单个核苷酸突变引起的DNA 序列多态性[16]。例如,PAN 等[17]研究发现,北京汉族人群血清TC在不同基因型之间存在差异。本研究发现,广西人群rs8022522位点AG 基因型的HDL-C 水平较GG 基因型HDL-C 水平低,提示rs8022522位点基因多态性与血清HDL-C水平存在相关性。

综上所述,miR-208基因rs8022522和rs12894524两位点在中国广西人群中存在基因多态性,其多态性与不同种族之间比较存在不同程度的差异,不仅为解释miR-208基因与其相关疾病的发生在不同种族间表现的差异提供一个新的方向,而且还丰富了人类群体遗传学资料,为进一步相关疾病防治的研究提供了参考资料。