黄花菜锈病病原菌及不同黄花菜品种的抗锈性鉴定

张黎杰，周玲玲，刘书华

（江苏省农业科学院 宿迁农科所，江苏 宿迁 223800）

关键字：黄花菜；锈病；病原菌；抗锈性

黄花菜（Hemerocallis citrina），又名金针菜，俗称金针花，百合科（Liliaceae）萱草属（Hemerocallis）多年生草本植物，是我国多地重要的特色经济作物[1-2]。黄花菜古时被称为“忘忧草”，作为食品和传统药品已有上千年历史[3-5]。黄花菜有多种用途，其花型美丽，具有很高的观赏价值；黄花菜的花蕾可食用，具有较高的营养价值；黄花菜含有黄酮类、多糖、多酚类、生物碱、皂苷等多种化学成分，据相关药典记载，其具有抗肿瘤、抗氧化、抗抑郁、催乳等多种药用功能[6-8]。

黄花菜适应能力强，在我国分布广泛，野生种质资源较多。从我国的湖南、河南到西北的甘肃及东北的黑龙江等地都有黄花菜种植区，山西大同、湖南祁东、甘肃庆阳、宁夏盐池、陕西大荔为我国黄花菜有名的五大产区[9]。从20世纪90年代以来，由黄花菜柄锈菌（Puccinia hemerocallidis）引起的黄花菜锈病，危害逐年加重，严重影响黄花菜的产量和品质，成为各黄花菜主产区最严重的三大病害之一，极大地制约了黄花菜产业的健康发展[10]。

目前，黄花菜锈病传统的防治手段是化学防治，这种防治不仅会对环境造成污染，也会对食品安全造成风险。此外，黄花菜柄锈菌具有多个生理小种且变异速度快，新的变异毒性小种会对化学药剂产生抗性，从而进一步降低化学药剂的防治效果[11]。因此，筛选、培育和利用黄花菜抗锈病品种是防治黄花菜锈病最为经济有效的措施之一，也是当前生产中急需解决的重要问题。本试验从黄花菜锈病病原菌鉴定入手，通过人工接种鉴定50份国内黄花菜种质资源的抗锈性，筛选抗锈种质资源，以期为黄花菜抗锈品种选育提供依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

50份黄花菜种质资源取自江苏省农业科学院宿迁农科所黄花菜种质资源圃，为各地收集的黄花菜种质资源，包括栽培种和野生种。

1.2 试验方法

1.2.1 黄花菜锈病样本采集方法

黄花菜锈菌是转主寄生锈菌，主要是通过夏孢子在黄花菜叶片上进行繁殖并不断侵染，而其冬孢子萌发产生的担孢子不会侵染黄花菜，因此，黄花菜锈病抗性鉴定需选用夏孢子的分离菌株进行扩繁鉴定，在锈病样本的采集过程中，主要在各地区采集夏孢子样本。于2018年和2019年的7—10月在甘肃、陕西、湖南、江苏黄花菜主要产区，从发生锈病的黄花菜的病叶上采集样本32份，标注品种名称。采摘病斑不相连的新鲜病叶10片左右，采后展平夹入脱水纸或羊皮纸袋，让病叶迅速脱水，注明采集时间、地点、品种名称等（表1），用以观察及测量夏孢子堆和夏孢子；2019年11月，再从江苏省农业科学院宿迁农科所的种质资源圃中选取黄花菜锈病样本1份（yx-30），观察并测量其冬孢子堆和冬孢子。

表1 黄花菜锈病标样采集明细

1.2.2 锈病及病原菌形态观察

对采集的锈病标样置于体视显微镜（徕卡EZ4W，德国）下观察黄花菜柄锈菌夏孢子堆、冬孢子堆的病斑显微结构；通过倒置显微镜（徕卡DMi1，德国）观察夏孢子和冬孢子形态，并进行拍照与测量。

1.2.3 黄花菜锈病扩繁接种方法

（1）培养：先将50份黄花菜的种苗定植于营养钵中，每个品种3次重复，然后放入光照培养箱中培养，保持温度25℃，湿度65%～70%，每天光照培养14 h，暗培养10 h。7 d左右，黄花菜可长出新叶1～2片，即可接种。（2）保湿：接种前用喷壶喷水，营养钵加盖闷养罩，保湿4～8 h。（3）脱蜡：揭盖用拇指反复摩擦黄花菜抽生出的新叶进行脱蜡，动作要轻，防止撕裂叶片。（4）摩擦：用海绵擦反复摩擦已脱蜡的黄花菜叶片，使叶片轻微受损。（5）雾化：用雾化加湿器雾化受损叶片表面，以不形成水滴为准。（6）接种：刮取夏孢子堆上的夏孢子粉，直接涂抹在受损叶片上。（7）加湿：继续雾化接种的黄花菜叶片表面。雾化接种好的黄花菜后，加盖闷养罩。（8）培养：温度28℃，湿度90%，每天光照培养14 h；温度22℃，湿度85%，暗培养10 h。保湿48 h，打开闷养罩通风。接种7 d以后，开始观察接种情况，10 d后鉴定发病情况。经前期菌株活性接种鉴定试验，发现yx-26菌株的活性强、致病力高，因此，本试验选用该菌株作为测试菌株，参照表2接种黄花菜柄锈菌（yx-26）后进行抗性等级鉴定。

表2 黄花菜锈病抗性分级标准

2 结果与分析

2.1 黄花菜柄锈菌夏孢子堆和夏孢子的形态学鉴定

通过体视显微镜观察了32份样本的黄花菜柄锈菌夏孢子堆形态学特征（表3）：黄花菜柄锈菌的夏孢子堆多生于叶片背面，形成橘红色或黄褐色疱斑，直径0.28～1.96 mm（图1）。初期定殖在叶片表皮下，不断增生后，表皮破裂，夏孢子溢出随气流或雨水扩散。

图1 黄花菜锈菌夏孢子堆显微观察（25×）

表3 黄花菜柄锈菌夏孢子形态学观察及测量

黄花菜柄锈菌夏孢子形态学特征（图2）：夏孢子近圆形或椭圆形，黄色、单胞，大小为（16.0～21.5）μm×（17.2～32.4）μm，壁厚1～3 μm，孢子内有数个黄色圆泡，也有全部溶解在一起的圆泡；有的圆泡伸长变尖，液泡黄色且向周边扩散，逐渐变透明；后期开始伸长变尖，形状逐渐不规则，黄色圆泡逐渐褪色。

图2 黄花菜锈菌夏孢子显微观察（600×）

2.2 黄花菜柄锈菌冬孢子堆和冬孢子的形态学鉴定

黄花菜柄锈菌yx-30冬孢子堆的颜色是在夏孢子堆的基础上变深，形成深褐色，呈絮状（图3）。黄花菜柄锈菌冬孢子：椭圆形、棒状，黄色，双细胞，中间有缢缩，形似葫芦，比萱草冬孢子略大偏长，大小为（68.0～81.0）μm×（19.4～22.2）μm，孢囊柄长11～16 μm（图4）。

2.3 黄花菜品种抗性鉴定

人工接种黄花菜锈病yx-26菌株10 d后（图5），对我国不同地区收集的50份黄花菜种质资源进行抗性鉴定，按照表2对黄花菜锈病yx-26菌株的抗性等级进行发病等级综合鉴定。结果表明，四月白、茄子花、茶子花、小黄壳、秋八尺等11个品种对yx-26菌株表现为高抗；大乌嘴、长泰、十八格、渠县花、台东6号、高山1号等21个品种表现为中抗；四月花、五月花、青冲、大同黄花、徐州黄花8个品种表现为感病；马兰花、沙苑花、猛子花、长嘴子花、线黄花、白花等10个品种表现为高感（表4）。

表4 国内黄花菜品种抗锈性鉴定

图5 接种锈菌14 d后不同抗感类型

3 结论与讨论

黄花菜柄锈菌属于“转主寄生型”，病菌需要在黄花菜、败酱草2种不同的寄主上完成全部生活史，而在黄花菜上只产夏孢子堆和冬孢子堆[12-13]。本试验通过显微结构观察到锈病病原菌的两种形态。通过对32份锈病样本的夏孢子堆和夏孢子进行显微观察，发现这些样本的夏孢子堆形态特征基本相似，但夏孢子形态大小略有差别。至于锈病发生的夏孢子阶段为什么夏孢子堆会呈现橘红色或黄褐色疱斑，本试验通过显微观察发现夏孢子内有数个黄色圆泡，这些黄色圆泡呈不同形态分散在夏孢子内，可能是夏孢子堆呈现为黄色或橘色的原因。

国外学者MUELLER等[14]和BUCK[15]对萱草进行人工接种鉴定的方法获得一些抗源材料，国内学者张瑞阳等[10]和邱亨池等[11]只是通过田间观测，调查黄花菜的抗锈水平。本试验利用人工接种方法鉴定黄花菜种质资源抗性水平，对我国黄花菜种质资源的抗锈性进行了科学评估，并对人工接种黄花菜柄锈菌接种扩繁的方法进行优化。因为黄花菜柄锈菌属于活体寄生菌，几乎无法进行人工培养，所以如何能够将黄花菜柄锈菌接种到黄花菜植株上，是本试验成功与否的关键。本试验在参考了李振岐等[16]小麦锈菌接种方法的基础上，通过对黄花菜柄锈菌接种方法的反复试验优化，认为湿度保持是黄花菜柄锈菌接种成功的关键，即接种前的保湿、接种时的雾化和接种后的加湿，因此本试验形成了培养、保湿、脱蜡、摩擦、雾化、接种、加湿、培养的规范工艺操作流程，大大提高了黄花菜柄锈菌的接种成功率。利用该方法接种黄花菜柄锈菌来判断黄花菜品种的抗锈性，只需要15 d左右的时间，相比田间鉴定，具有培养条件可控、鉴定周期短、成本低、速度快、准确率高的优点。

从品种上来看，50份黄花菜种质资源中，抗病品种11份、中抗品种21份、感病品种8份、高感品种10份，中抗以上抗病品种占所有品种的3/5（32份），感及以下材料占1/3（18份），说明我国黄花菜抗病品种资源比较丰富。徐州红花、新疆引、金菇花、野生种4个品种是红花品种，但均是抗锈病品种；黄鹤楼是重瓣品种，也是抗病品种；其余45份是黄花品种，只有四月白、茶子花、茄子花、小黄壳、秋八尺、黄花6个品种是抗病品种，说明红花品种和重瓣品种较黄花品种更抗锈病。

从地区来看，不同地区主栽品种对黄花菜的抗锈性是不同的，有些地区的主栽品种虽品质优但不抗锈病，如湖南祁东的主栽品种猛子花、冲里花，山西大同的黄花，陕西渭南的沙苑花，甘肃庆阳的马兰花和线黄花；有些地区的主栽品种是抗病的，如江苏宿豫的大乌嘴；但每个地区也有其他非主栽的抗锈品种可供选择，如湖南的四月白、茶子花、茄子花，甘肃的马莲黄花等。本试验今后将对各地区黄花菜栽培品种的合理选择和规划进行研究，以期进一步为各单位开展黄花菜抗锈病育种提供科学依据。此外，不同黄花菜柄锈菌的致病力不同，而且同一黄花菜对不同生理小种的抗性表现也不同，本试验只是利用yx-26分离株对50份黄花菜种质资源的抗性进行了初步鉴定，后续试验还应该对锈菌菌株进行生理小种分类鉴定和毒力测定，再对黄花菜种质资源抗锈性进行综合评判。