茶树白化果皮超微结构观察及分子机制研究

汤榕津，刘浩然，刘丁丁，张晨禹，龚洋，叶圆圆，陈杰丹，陈亮，马春雷*

1. 中国农业科学院茶叶研究所/农业农村部特种经济动植物生物学与遗传育种重点实验室，浙江 杭州 310008；2. 中国农业科学院研究生院，北京 100081

茶树是我国传统木本叶用经济作物，在长期的自然选择及人工繁育下发生了丰富的表型变异，现有的种质资源从外形到生化成分等方面各具特色。其中，茶树叶色白化突变类型丰富，其研究范围涵盖了生理生化、细胞学、分子生物学等多方面。以前的研究表明，茶树叶片的白化常常伴随着叶绿体发育缺陷现象的发生，如叶绿体内部空泡化，缺乏类囊体片层等，但大多数茶树资源的叶绿体在特定条件下又可恢复正常[1]。以茶树白化叶片与返绿叶片为材料的研究中，转录水平的差异表达基因主要富集于光合作用、叶绿素、活性氧清除等代谢通路[2-4]；而代谢组所获得的差异代谢物则主要参与了碳水化合物代谢、氨基酸代谢、次级代谢物合成等通路[5-6]。但白化突变的形成机理实际上十分复杂，除了与叶绿体的异常发育或叶绿素合成、降解相关途径的基因突变有关之外，核质信号转导、转录因子的调控以及表观遗传的作用等均有可能引起植株的白化表型[7]。叶色白化突变体在自然界中是较为常见的变异类型，但其他组织或器官出现白化的情况仍较少见，仅少量研究提及玉米籽粒[8]、大麦颖壳[9]、甘蓝形油菜角果[10]和甘蓝种荚[11]的特异性白化。

本课题组在国家种质杭州茶树圃保存的众多叶色变异资源中发现了一份叶色呈现出非纯色系白化、果皮呈现白色表型的珍贵特异资源——云白1号，其种子播种后仍可正常发育，且一年生幼苗未出现任何白化或其他生长缺陷现象。在茶树中，有关果皮白化的表型目前未能查阅到相关报道，为进一步探讨白化果皮的形成原因，本研究采用转录组测序技术对云白1号、中茶129的果皮、种子进行分析，比较两个茶树品种的不同组织在转录层面的差异，以期为深入研究白化果皮的分子机理提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

于2020年8月上旬在国家种质杭州茶树圃采集云白1号（YB1）和中茶129（ZC129）的一芽二叶新梢（图1-A、E）和已成熟的果实（图1-B、F），将采集到的果实剥开，留取新鲜果皮组织和种子分别保存，部分果皮切片后放于固定液中保存，用于后续超微结构的观察；其余组织用液氮迅速固定并置于-80℃冰箱保存，用于转录组测序。

图1 中茶129、云白1号果皮细胞在不同放大倍数下的超微结构图Fig. 1 Ultrastructure of pericarp cells of ‘Zhongcha 129’ and ‘Yunbai 1’ at different magnification

1.2 透射电镜扫描果皮结构

将果皮切成1 mm×1 mm左右的组织薄片后放入电镜固定液进行前固定，之后组织薄片经漂洗、后固定、室温脱水、渗透包埋、聚合等步骤制成树脂块，使用超薄切片机切片。切片经染色、清洗、干燥等步骤后，放置于透射电子显微镜下采集果皮超微结构图像。

1.3 转录组测序及数据分析

1.3.1 文库的构建、测序及比对

每个样本设置 3个生物学重复，使用Trizol试剂盒提取总RNA，对纯度、浓度等进行检测后富集带有 polyA结构的高质量mRNA，采用随机引物对片段化后的 mRNA进行反转录，初步构建 cDNA文库。此后经PCR富集、片段筛选、质量检测、混合稀释、碱变性等步骤建立单链文库。在 Illumina HiSeq平台对文库进行双末端测序，去除原始下机数据中的低质量或含有接头的 reads，将获得的高质量reads比对至舒茶早茶树染色体级别参考基因组[12]，得到BAM文件。

1.3.2 差异表达基因的筛选及富集分析

使用HTSeq软件将BAM文件比对至参考基因组的结构注释文件，统计比对到每一个基因上Read count值，作为基因的原始表达量，采用FPKM对表达量进行标准化。利用DESeq软件分析基因的差异表达，以表达差异倍数|log2FoldChange|＞1，P＜0.05 对差异表达基因进行筛选。以整个基因组为背景，采用BinGO、R语言、TBtools分别绘制GO柱状图、KEGG气泡图、表达倍数热图。

2 结果与分析

2.1 果实的表型及果皮细胞超微结构

在中茶129和云白1号果皮的超微结构扫描电镜图中发现（图1），两者的叶绿体分布情况以及生长发育状况不同，中茶129的绿色果皮细胞中仅具有少数叶绿体，其基粒和基粒片层均尚未形成，处于发育初期，分布于细胞壁附近（图1-C，1-D）。相比而言，云白1号白色果皮细胞中的质体内部高度空泡化，缺乏类囊体和基粒等结构，不存在正在发育或发育成熟的叶绿体（图1-G，1-H），这与拟南芥pds3白化突变体[13]、中茶108白化芽变枝条[14]叶肉细胞的超微结构类似，可能意味着云白1号果皮细胞中的前质体失去正常分化功能，无法进一步形成叶绿体。因此，云白1号果皮白化表型的产生与其细胞内质体阶段的发育缺陷密切相关。

2.2 转录组测序质量分析

测序结果表明，18个文库的 clean reads比率、Q30均大于 92%（表1），说明测序质量良好。果皮和新梢的clean reads比对至参考基因组的百分比较高，均达到87%以上，说明这两个样本的测序质量良好；而种子的比对率则处于67.51%～78.01%，这可能是种子组织作为茶树转录组的研究材料具有一定的特殊性，数据库缺乏充分的参考信息所致。

表1 测序质量及参考基因组比对结果统计表Table 1 The statistics of sequencing data and mapping data

2.3 转录组样本的主成分分析

对18个样本的转录本表达量信息进行主成分分析（Principal component analysis，PCA）与聚类分析（图2），结果显示，第一主成分（PC1）的贡献率为43.583%，第二主成分（PC2）的贡献率为28.212%，各样品的重复性较好，且按照样本组织类别两两相互聚集，而非按照品种类别区分开来。这表明两个主成分所代表的各组织之间的转录本信息差距大于两个品种相同组织之间的转录本信息差距，反映了茶树的组织特异性，推测与相同组织中的基因执行相似的生物学功能有关。同时，此聚类结果也意味着不同品种的相同组织之间的转录组比较能够在一定程度上减少与目标表型无关的信息噪音，提高样本比较的可信度。因此，本研究以不同果皮、不同种子作为差异组合，分析组合间的基因表达差异。

图2 18个样本的转录组PCA得分Fig. 2 Expression data of 18 transcriptome sample analyzed by PCA

2.4 差异表达基因分析

对果皮和种子的转录组数据分别进行差异表达分析并绘制火山图（图3），结果显示，云白1号和中茶129果皮之间的差异基因数目较多，一共筛选出7 537个，其中上调的基因为3 616个，包含云白1号果皮中特异表达的基因508个；下调的基因为3 921个，包含中茶 129果皮中特异表达的基因 639个（图3-A）。种子之间的差异基因数目较少，仅筛选出2 612个，其中上调的基因为1 233个，包括在云白1号种子中特异表达的基因137个；下调的基因为1 379个，包括在中茶129种子中特异表达的基因 179个（图3-B）。与中茶129相比，云白1号的果皮以及种子的下调基因数目较多，特异性表达的基因数目较少，这部分差异基因的表达模式可能与白化果皮的形成有所关联。

图3 差异基因火山图Fig. 3 The volcano plots of DEGs

2.5 GO富集分析

为进一步研究差异基因涉及的生物学功能，将中茶129与云白1号的果皮差异基因与种子差异基因分别进行了GO功能富集分析。结果显示，果皮差异基因在细胞组分类别中主要富集在与叶绿体、质体相关的功能条目中；在生物学过程类别中差异基因主要参与有机酸代谢过程与小分子代谢过程；在分子功能类别中，差异基因的功能主要与催化活性相关（图4-A）。其中，质体相关功能条目中共富集了269个上调基因及327个下调基因，这些基因主要参与了光合作用、有机酸代谢、胺生物合成代谢、金属离子转运等过程。说明相比于绿色果皮，白化果皮中的光合作用、碳代谢及氮代谢通路相关基因的转录水平发生了较大的变化，这与果皮超微结构观察的结果相符，推测这一结果可能是由于白化果皮中呈现异常状态的质体未能进一步形成具有完整结构的叶绿体，使得多数在叶绿体被膜或类囊体膜上装载或在叶绿体内部行使功能的基因无法正常表达而导致的。

图4 差异表达基因的GO分析Fig. 4 GO analysis of differentially expressed genes

中茶129与云白1号种子转录组GO分析表明（图4-B），差异基因主要显著富集在生物学过程和分子功能下的氧化还原过程及氧化还原酶活性条目中，在该条目中植物组织抗氧化相关的基因如编码谷胱甘肽硫转移酶合成、谷胱甘肽过氧化物酶合成的基因表达上调十分明显。此外，属于分子功能的条目大多与离子转运有关，表明云白1号的离子运输方式发生了改变。在所有离子转运途径中，与镉离子相关的通路所富集的基因数目最多，其中包含与植物应激反应相关的调控基因如亲环素编码基因，受植物激素及镉离子诱导的转录因子MYB59等，这些基因的表达量均显著上升。而为植物生长发育提供必要硫化物的硫酸盐同化途径关键酶 ATP-硫化酶的编码基因表达量则明显下降，这些变化趋势表明在云白 1号种子内与胁迫及生长发育相关的代谢过程与中茶129种子存在较大差异。

2.6 KEGG富集分析

KEGG的富集分析显示（图5-A），相比于中茶129，在云白1号果皮中上调的差异基因主要富集于氨基酸代谢，碳水化合物代谢，半乳糖代谢，谷胱甘肽代谢，半胱氨酸和甲硫氨酸代谢，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成等代谢通路中；下调的差异基因显著富集于光合器官的碳固定，光合作用蛋白，甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢，光合作用，半胱氨酸和甲硫氨酸代谢等通路中。这些通路中富集的差异基因主要在质体/叶绿体中发挥功能，不仅参与了光合作用有关的通路，还参与了在质体/叶绿体中发生的氨基酸代谢、碳代谢等初级代谢过程，这些基因的差异表达极可能与云白1号质体发育的停滞相关。

图5 差异表达基因的KEGG富集分析Fig. 5 The KEGG pathway analysis of DEGs

种子差异基因的KEGG富集结果显示（图5-B），云白1号种子中上调的差异基因富集于核糖体，萜类、哌啶和吡啶生物碱的生物合成，丙酮酸代谢，糖酵解/糖异生等通路；下调的差异基因富集于β-丙氨酸代谢，转运RNA生物合成，乙醛酸和二羧酸代谢，甘油酯代谢等通路。茶树种子含油率较高，其生命历程与油料种子相似，常以三酰甘油作为高效储能形式为萌发提供必要的碳骨架和能量[15]。一旦种子萌发的信号触发，三酰甘油将经脂肪酸降解途径转变为蔗糖，为组织器官的生长分化提供碳源及能量。因此，差异基因所富集的通路可能反映了云白1号与中茶129种子在生长发育进程上的不一致。

2.7 差异基因在KEGG通路中的表达量分析

2.7.1 果皮中与光合作用相关的差异基因

在光反应中（图6），光合天线蛋白、光系统Ⅰ、光系统Ⅱ、光合电子传递链以及ATP合成酶的相关调控基因大多在云白 1号果皮内下调表达，这些基因编码的蛋白包括了捕光色素叶绿素a/b结合蛋白（Light harvesting chlorophyll a/b binding protein，LHC）、铁氧还蛋白-NADP+氧化还原酶（Ferredoxin-NADP+oxidoreductase，FNR）以及 ATP合成酶亚基蛋白等。光合天线蛋白是光反应中不可或缺的部件，LHC表达量的下调将阻碍光能在类囊体中的吸收和传递，而FNR和ATP合成酶所产生的同化力可直接用于暗反应的卡尔文循环，两者调控基因的下调则意味着碳固定过程产生了一定的变化。

而在卡尔文循环中（图6），上调的基因主要编码1,5-二磷酸核酮糖羧化酶（Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase，RCA）、磷酸甘油酸激酶（Phosphoglycerate kinase，PGK），这些酶均处于卡尔文循环的初始反应阶段；下调的基因则主要参与编码卡尔文循环的中间酶，例如3-磷酸甘油醛脱氢酶A/B（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase A/B，GAPA/B）、5-磷酸核糖异构酶、果糖二磷酸醛缩酶、磷酸丙糖异构酶以及转酮酶等；在非绿色质体中调控3-磷酸甘油醛脱氢酶合成相关的基因则存在两种相反的表达模式。RCA、PGK是卡尔文循环的关键酶，在多数情况下受非生物胁迫的刺激而提升表达量用以维持植物的碳同化速率，云白1号果皮中这两个酶有关的基因表达倍数的提升可能说明了白化果皮正处于抵抗胁迫的状态中。

2.7.2 种子中的β-氧化途径相关的差异基因

云白1号和中茶129种子的差异基因在脂肪酸降解途径中显著富集，β-氧化是脂肪酸降解的主要途径，其产物乙酰辅酶 A可为糖异生和三羧酸循环提供底物，因此脂肪降解途径对种子的生长发育意义重大。脂肪酸在进入降解途径前，需要经过酰基辅酶 A合成酶的活化后进入β-氧化途径（图7），而呈现下调表达模式的长链酰基辅酶 A合成酶极可能刺激β-氧化循环中一系列基因表达量的调整变化，导致长链脂肪酸降解过程发生异常。此外，β-氧化循环的限速酶酰基辅酶 A氧化酶、参与反应第二三步骤的多功能蛋白以及直接催化乙酰辅酶A生成的3-酮脂酰-CoA硫解酶等基因表达量均存在一定变化，这可能意味着云白1号种子中的油脂组成发生了改变。

图7 种子差异基因在脂肪酸降解途径中的表达情况Fig. 7 The expressions of DEGs of pericarps in the pathway of fatty acid degradation

3 讨论

白化突变体的产生大多与叶绿体的非正常发育有关，如拟南芥白化突变体的超微结构显示，叶绿体缺乏基质和垛叠的类囊体片层，且其内部高度空泡化，聚集了大量球状结构[16]；玉米光合突变体的叶绿体则存在类囊体发育不全、片层结构松散的情况[17]；茶树白化叶片的叶绿体有体积膨大、类囊体片层缺乏或松散、内部空泡化或具有不同程度的降解等现象[18-19]。本研究通过透射电镜观察果皮细胞的超微结构，发现茶树绿色果皮细胞中仅有少数叶绿体附着于细胞壁，其内部结构虽然还未发育完全，但是处于正常的生长阶段；而白化果皮细胞不存在处于生长发育阶段或已发育成熟的叶绿体，其内部仅观测到高度空泡化的质体，这与叶色完全白化突变体的研究结果相似[13-14]，表明云白 1号果皮细胞中的质体在发育的某一个阶段产生停滞、降解，失去形成叶绿体的功能，因而产生特殊的白化表型。

叶绿体是光合作用的主要场所，光反应和暗反应能为碳代谢和氮代谢提供基本能量和有机物质，碳代谢所生成的中间产物酮酸同时也为叶绿体中谷氨酸转化成其他氨基酸提供了碳骨架。在茶树叶色白化突变体中，异常发育或严重降解的叶绿体导致光合作用无法正常运转，而光合碳固定的削弱（碳饥饿）会促使碳-氮代谢的重新平衡，因此相较于正常的绿色品种，白化叶片中的有机酸和氨基酸会存在一定程度的积累[20-21]，这也在果皮差异基因的 GO富集和 KEGG富集结果中得以体现。在白化果皮中，与PSⅡ的光损伤蛋白质修复、类囊体形成相关的基因FTSH1、FTSH2的表达量上调，参与光反应的基因LHC、FNR、PSA、PSB的表达量下调，LHC负责吸收、转移光能至光反应中心，是光系统复合物的重要组成部分，其调控基因的下调意味着光能吸收传递过程受阻，长期可能会造成叶绿体内部活性氧的积累，干扰叶绿体的正常发育[22]。在光反应中，FNR是催化线性电子传递的最后一步，其主要功能是转移电子将 NADP+还原为NADPH，为CO2固定提供还原力。因此，FNR的下调会直接影响光合作用，从而导致光合碳固定效率的降低[23-24]。RCA、PGK、GAPA/B是卡尔文循环的关键酶，其中RCA同时参与了暗反应和光呼吸两个代谢路径，能够根据CO2/O2的浓度比值调整羧化、还原反应，对净光合速率有着重要的影响[25]；PGK、GAPA/B分别消耗来自光反应的ATP和NAPDH，催化3-磷酸甘油酸生成净光合产物3-磷酸甘油醛，3-磷酸甘油醛可经过一系列的后续反应转化为淀粉、蔗糖或脂肪，为植物的生长发育提供基本物质[26]。在云白1号果皮中参与卡尔文循环的大多数基因在转录水平上发生了变化，而RCA、PGK上调、GAPA/B下调则可能是白化果皮抵抗胁迫，维持光合碳同化效率的策略。

种子处于植物生命生长发育的一个初始阶段，涉及能量的储存转化或物质的协调分配，因此，中茶129和云白1号种子的差异基因在碳代谢、脂质代谢、核苷酸代谢等初级代谢通路中有着更为明显的富集。脂质是茶树种子储藏能量的高效形式，种子发芽前，源器官如叶片、果皮的光合产物蔗糖被转运至种子细胞中，经糖酵解等过程转化为乙酰辅酶A，为脂肪酸的合成提供前体物质；发芽时，种子中储存的脂质则将经β-氧化、乙醛酸循环、糖异生等途径转变成蔗糖的形式，为即将生长分化的其他组织器官提供碳源。在蓖麻和油茶种子中，蔗糖与油脂呈现极显著负相关，且两者的动态平衡关系在一定程度上反映着种子所处的生长发育阶段[27-28]。本研究中，云白1号和中茶 129种子的脂肪酸合成代谢通路中的基因在表达量上并无差异，但云白1号的种子中β-氧化、乙醛酸/二羧酸循环、糖酵解/糖异生代谢通路相关基因的表达量发生显著变化，其中乙醛酸循环的差异基因以下调为主，糖酵解/糖异生的差异基因则以上调为主，表明云白1号种子中的脂肪酸降解过程不如中茶 129旺盛。因此，在云白1号中，用于供应种子生长发育的能量要低于中茶129，但如果云白1号用于合成脂肪酸前体所需的蔗糖得到了充足供应，则能在一定程度上满足其种子后续生长发育的需求。

绿色果皮细胞内含有叶绿体，同样也能进行光合作用，属于非叶光合器官。在甘蓝型油菜和油菜中，其绿色角果同样可作为源器官向库器官（主要为种子）供应光合同化物，角果的不良发育会对种子的含油量、粒重等生理指标产生较大影响[10,29]。然而在大麦中，其颖壳的白化并不会导致大麦的结实率降低和抗病性减弱，但会在一定程度上影响籽粒干物质的积累[9]；此外，甘蓝种荚白化突变体可产生少量种子，属于非致死突变[11]。实际上，叶片是光合作用的主要器官，可作为源器官直接向库器官比如种子提供光合同化物，用于满足种子的基本生长发育需求，因此果皮的白化并不意味着种子丧失了发芽的能力[30]。蔗糖作为光合作用的主要产物，其分解代谢在碳资源、能量的协调分配中发挥重要作用，其中，蔗糖合酶（Sucrose synthase，SUS）、转化酶（Invertase，INV）是蔗糖分解代谢的关键酶[31]。SUS可调控光合同化物从源器官向库器官的转运，在种子发育、响应逆境胁迫等过程中发挥着不可忽视的作用[32]；INV催化蔗糖水解成葡萄糖和果糖，可维持细胞渗透压，并调节蔗糖在植物体中的运输装载[33]，其活性的缺失会降低光合作用的水平，减少库器官的库强[34]。在本研究中，INV的调控基因在云白 1号的种子中特异表达、SUS相关编码基因的表达显著上调，说明蔗糖分解代谢在云白1号种子中的活性较高，可能是为了满足种子的营养物质储存需求，维持其正常生长发育进程。因此，尽管茶树白化果皮在转录水平上的异常变化可能会对种子不利，导致种子的生长发育机制出现调控差异造成生理指标等方面的变化，但并不一定会影响种子的发芽能力。为了深入了解白化果皮的遗传特性，本课题组对云白1号的种子进行了播种繁育，目前已获得健康的一年生幼苗，说明云白1号种子具有正常的生长活力。此外，表型观察发现，所有一年生幼苗均未出现任何白化变异，初步推测云白1号的白化现象可能是由隐性基因控制。由于茶树的自交不亲和性，云白1号接触外界绿色茶树植株传递而来的花粉时，其控制白化果皮的基因在子代中大概率为杂合基因，因而云白1号子代果皮表型呈现出绿色的表型，但相关推测需通过进一步的表型观察与杂交试验进行验证。