抗、感西瓜根系分泌物鉴定及对枯萎病菌生长的影响

张玉锦，周文丽，崔梦娇，耿二康，苗巧艺，杨嵩涵，吕桂云

（河北农业大学园艺学院 河北保定 071000）

西瓜枯萎病是由尖孢镰刀菌西瓜专化型（Fusarium oxysporumf. sp.niveum）寄生所引起的一种土传病害[1]，严重降低西瓜的产量及品质，从而导致病田减产，一般减产20%～30%，严重可达50%～60%，甚至绝产[2]。已鉴定的生理小种有0、1、2、3，其中生理小种1 为我国优势小种[3]。目前，西瓜枯萎病常用的防治方法有化学药剂、嫁接、轮作换茬、抗病育种等[4]，但化学药剂不能有效防治枯萎病的发生，并且极易造成环境污染；嫁接又操作繁琐且极易降低果实品质；轮作防治容易受到土地资源的限制；抗病育种因抗病资源匮乏、抗病遗传规律复杂，现阶段商品品种中抗病品种还比较少，还未选育出能抗所有生理小种的品种。因此，枯萎病成为西瓜生产中的主要限制因素之一。

根系分泌物是植物与土壤及土传病菌相互作用的桥梁，其不仅可以通过改变土壤环境间接抑制土传病菌，还可以通过自身作用直接抑制土传病菌[5]。国内外众多学者对植物根系分泌物进行了研究，发现香蕉抗感品种根系分泌物的酚酸含量在接菌前后发生了改变，接菌后抗病品种特有的对羟基苯甲酸、肉桂酸，以及含量多于感病品种的邻苯二甲酸都对尖孢镰刀菌古巴专化型（Fusarium oxysporiumf. sp.cubense）4 号生理小种的生长起抑制作用[6]；抗病棉花品种根系分泌物中绿原酸含量多于感病品种，对病原菌的抑制作用较强，耐病品种根系分泌物中绿原酸含量较少，对病原菌先促进后抑制，感病品种根系分泌物中没食子酸含量较高，其对菌丝生长有明显促进作用[7]；甜瓜抗感品种根系分泌物中酚酸种类不同，抗病品种根系分泌物中含有邻苯二甲酸二丁酯和苯甲酸苄基酯等，对病原菌有抑制作用，感病品种根系分泌物中含有邻苯二甲酸、丁香酸、苯甲酸等，对病原菌有促进作用[8]。在对棉花枯萎病[9]与烟草黑胫病[10]的研究中，抗病品种根系分泌物抑制病原菌生长，感病品种根系分泌物促进病原菌生长。但关于西瓜抗、感品种间根系分泌物的组分及其与枯萎病菌的相互作用还未见报道。

笔者分别以2 个抗、感西瓜品种为材料，采用水培法和气相色谱质谱仪分析，研究不同抗性的西瓜品种在接菌与不接菌条件下，根系分泌物的组成成分及其对枯萎病菌菌丝生长、孢子萌发和产孢量的影响，进一步明确根系分泌物接菌前后成分的变化及其对枯萎病菌生长的影响，为阐明根系分泌物与枯萎病菌互作提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

西 瓜 品 种：Sugarlee，SL（抗 病 品 种，R）；Calhoun Gray，CG（抗病品种，R）；早佳8424，ZJ（感病品种，S）；Sugarbaby，SB（感病品种，S）。其中SL，CG，SB 由北京市农林科学院蔬菜研究中心许勇研究员惠赠，ZJ 从山东寿禾种业有限公司购买。枯萎病菌生理小种1（Fusarium oxysporumf. sp.niveumrace 1）由河北农业大学设施实验室提供，西瓜品种的抗病性已在前期试验中得到验证。

1.2 方法

试验于2021 年3—8 月在河北农业大学创新试验园内进行。将西瓜种子用纱布包好后在1.5%的次氯酸钠溶液中浸泡15 min，消毒后洗去黄色，于28 ℃黑暗培养箱中催芽后播种。采用50 孔穴盘育苗，待西瓜2 叶1 心时，换至装有21 L 营养液（Hoagland）的塑料盒中进行水培，5 d 后进行接菌处理。将生理小种1 接种到PL 培养基中，于摇床培养7 d后，经过菌液过滤、离心，用超纯水溶解孢子沉淀并调整浓度到5×108CFU·mL-1。接菌前换新营养液，将孢子液倒入4 个接菌处理组中（Inoculation，In），接菌处理组中的孢子浓度最终为5×106CFU·mL-1[11]，对照的4 个处理组不接菌（Uninoculation，Un），加入等量蒸馏水。共8 个处理组，每个处理3 盒，每盒16 株苗。在处理后的3、6、9、12 d 取样收集根系分泌物，每组至少取3 株，3 次重复。从营养液中取出幼苗后冲洗根部，将幼苗放入盛有超纯水的锥形瓶中，超纯水的量需没过根系[12]。将锥形瓶在阳光下放置4 h 后，倒出溶液并过滤，所得的滤液冷冻干燥至干。由于根系分泌物中所含物质的极性有所不同，因此用丙酮、乙酸乙酯、石油醚、去离子水各3 mL 溶解根系分泌物冻干物，将溶解后的液体混合后放置4 ℃冰箱中。试验共4 个品种，每个品种进行接菌和不接菌处理，各4 个取样时间点，每个时间点取样3 次，共有96 管根系分泌物样品。

1.3 项目测定及方法

1.3.1 根系分泌物成分分析 将处理后3、6、9、12 d 收集的溶解液各取2 mL，均匀混合后，用GC-MS 检测溶解液中的成分。所用仪器由Agilent公司提供：6890 GC/5973 MSD，色谱柱为HP-5 MS毛细管柱。以He 作为载气，1 mL·min-1的流速，1 μL 体积的进样量。程序升温到柱温80 ℃，0.5 min 后以15 ℃·min-1升温，到230 ℃时停顿0.5 min，以20 ℃·min-1升 温，到280 ℃时 停 顿20 min 后开始测定。扫描范围30～600 m·z-1，70 eV轰击电压，250 ℃离子源温，四极杆温度200 ℃全扫描方式。

1.3.2 根系分泌物对病原菌菌丝生长和孢子萌发的影响 制备PDA[13]培养基，在PDA 不烫手时加入过滤除菌后的根系分泌物，体积比为1∶2，对照组加入等量无菌水，混匀后倒入培养皿中。培养基凝固后在中央接种大小一致的枯萎病菌菌饼，试验重复3 次，随后观察根系分泌物对菌丝生长的影响；调整孢子悬浮液的浓度到1×103CFU·mL-1，将0.1 mL 的孢子悬浮液涂布于PDA 上，封口膜密封后，于28 ℃下倒置培养，7 d 后计算菌落直径[14]并记录平板上的菌落数，用于观察根系分泌物对孢子萌发的影响。

菌丝生长促进率/%＝（处理组菌落面积－对照组菌落面积）/（对照组菌落面积－菌饼面积）×100；

菌丝生长抑制率/%＝（对照组菌落面积－处理组菌落面积）/（对照组菌落面积－菌饼面积）×100；

孢子萌发促进率/%＝（处理组菌落数－对照组菌落数）/对照组菌落数×100；

孢子萌发抑制率/%＝（对照组菌落数－处理组菌落数）/对照组菌落数×100。

1.3.3 根系分泌物对病原菌产孢的影响 在PL 培养基中加入过滤除菌后的根系分泌物，体积比为1∶2，对照组加入等量的无菌水，混匀。将浓度为2×105CFU·mL-1的孢子悬液0.1 mL 加入到PL 培养基中，于25 ℃、125 r·min-1的摇床中培养。7 d 后经过菌液过滤、离心，用去离子水溶解孢子沉淀，在显微镜下采用血球计数板记录3 个相邻视眼内的孢子数。

孢子产生促进率/%＝（处理组孢子数－对照组孢子数）/对照组孢子数×100；

孢子产生抑制率/%＝（对照组孢子数－处理组孢子数）/对照组孢子数×100。

1.4 数据分析

采用Microsoft Excel 2016、SPSS 20.0 软件进行数据分析与作图，采用Duncan 新复极差检验法进行多重比较检验差异显著性。

2 结果与分析

2.1 抗感西瓜品种根系分泌物成分的鉴定

由表1 可知，抗、感西瓜品种根系分泌物中共检测出10 大类，25 种物质。只在抗病品种根系分泌物中鉴定出的物质为十一烷和苯酚，CG 接菌后十一烷、苯酚分别减少44.13%、100.00%，SL 接菌后十一烷、苯酚分别减少89.12%、59.15%。只在2 个感病品种根系分泌物中共同鉴定出的物质为二十烷、硅烷、棕榈酸、2-戊烯二酸、癸二酸双酯、3-羟基-2，4，6-三溴苯甲醛和D-甘露醇。ZJ 接菌后二十烷和D-甘露醇含量分别增加125.93%、88.89%，其他5 种物质含量分别减少100.00%、32.89%、70.00%、43.18%、100.00%；SB 接菌后D-甘露醇含量增加485.71%，其他6 种物质分别减少93.10%、100.00%、40.28%、100.00%、77.78%、90.24%。接菌后感病品种ZJ、SB 中D-甘露醇含量增加，推测D-甘露醇可能与西瓜感病有关。在抗、感品种根系分泌物中鉴定到十八烷酸和邻苯二甲酸二丁酯，接菌后，抗病品种CG、SL 中十八烷酸含量分别增加79.49%、112.68%，邻苯二甲酸二丁酯含量分别减少96.33%、25.93%；感病品种ZJ、SB 中十八烷酸含量分别减少6.00%、37.66%，邻苯二甲酸二丁酯含量分别减少19.67%、24.14%。推测十八烷酸可能与西瓜抗病有关，邻苯二甲酸二丁酯含量改变可能与病菌侵染有关。综上，十一烷、苯酚、硅烷、棕榈酸、癸二酸双酯、2-戊烯二酸、3-羟基-2，4，6-三溴苯甲醛、邻苯二甲酸二丁酯等物质含量的改变可能与枯萎病菌侵染有关，十八烷酸可能与西瓜对枯萎病的抗性有关，D-甘露醇可能与感病有关。

表1 西瓜根系分泌物的组成成分

2.2 根系分泌物对病原菌菌丝生长的影响

由表2 可以看出，与对照相比，2 个感病品种未接菌处理3～12 d 的根系分泌物菌落直径增加了0.90～3.04 cm，促进率为19.87%～67.11%，第3天促进作用最强；接菌后3～9 d 根系分泌物菌落直径大于未接菌菌落，促进率提高了2.88%～12.36%。与对照相比，抗病品种未接菌处理的3～12 d 的根系分泌物菌落直径减少了1.84～3.87 cm，抑制率为37.02%～77.87%，第9 天的抑制作用最强；接菌后根系分泌物的菌落直径小于未接菌菌落，抑制率提高了2.01%～9.26%。感病品种根系分必物对病原菌菌丝的促进作用在前期较为明显，抗病品种的抑制作用在中期较为明显。

表2 根系分泌物对枯萎病菌菌丝生长的影响

2.3 根系分泌物对病原菌孢子萌发的影响

由表3 可以看出，与对照相比，感病品种未接菌处理3～12 d 的根系分泌物菌落数增加了2.00～6.00 个，促进率为21.18%～81.82%，第12 天的促进作用最强；接菌后3～9 d 根系分泌物的菌落数多于未接菌菌落，促进率提高了4.55%～22.73%。与对照相比，抗病品种未接菌处理3～12 d 的根系分泌物菌落数减少了1.66～6.00 个，抑制率为13.51%～40.54%，第12 d 的抑制作用最强。接菌后根系分泌物的菌落数少于未接菌菌落，抑制率提高了2.00%～21.62%。

表3 根系分泌物对枯萎病菌孢子萌发的影响

2.4 根系分泌物对病原菌产孢量的影响

由表4 可以看出，与对照相比，感病品种未接菌处理3～12 d 的根系分泌物孢子数增加了1.33～6.00 个，促进率为15.38%～72.00%，第12 天的促进作用最强；接菌后3～9 d 根系分泌物的孢子数多于未接菌孢子数，促进率提高了11.54%～44.00%。与对照相比，抗病品种未接菌处理3～12 d 的根系分泌物孢子数减少了2.34～8.33 个，抑制率为17.11%～58.14%，第12 天的抑制作用最强；接菌后根系分泌物的孢子数少于未接菌孢子数，抑制率提高了2.33%～14.63%。

表4 根系分泌物对枯萎病菌产孢量的影响

3 讨论与结论

不同抗性作物品种根系分泌物的组成成分存在差异并且在病原菌侵染下会发生改变，目前发现根系分泌物的组成成分主要有糖类、苯类、酚类、酯类和酸类等[15-17]。在对西瓜丛枝菌根真菌研究中发现，感病品种接种枯萎病菌后，丛枝菌根真菌降低了根系分泌物中琥珀酸和草酸含量，提高了香豆酸和苹果酸的含量，植株发病减轻，抗性增强[18]。抗枯萎病香蕉品种根系分泌物中乙酸和脯氨酸的含量高于感病品种[19]。抗枯萎病草莓品种根系分泌物中邻苯二甲酸二丁酯含量高于感病品种，阿魏酸、丁香酸等含量低于感病品种[20]。在对烟草黑胫病的研究中发现，抗病品种接菌后根系分泌物中水杨酸、阿魏酸等含量高于感病品种，酒石酸、月桂酸等含量低于感病品种[21]，其通过抑制病原菌生长增强抗病性。赵媛媛[22]研究发现，接菌后辣椒根系分泌物中正十八烷的含量与抗病性呈正相关。汤丽川等[23]发现，十八碳脂肪酸含量的提高可以抑制大豆种子传播的茎溃疡病菌的定殖。黄玉茜等[24]发现，高浓度的花生根系分泌物中，D-甘露醇可作为碳源影响土壤微生物群落结构多样性，从而导致连作障碍。前人研究发现，根系分泌物中酚类、酸类以及酯类可能与抗病有关，部分酸类可能与感病有关，其可以通过自身作用直接抑制病原菌生长，也可以为病原菌提供碳源促进其生长[25]。在笔者的研究中，抗、感品种根系分泌物组成成分存在差异并且接菌前后发生了改变，其中十八烷酸在抗、感品种根系分泌物中均鉴定到，但接菌后抗病品种CG 和SL 中十八烷酸的含量增加，感病品种ZJ 和SB 中含量减少，可能与西瓜抗病有关，D-甘露醇仅在感病品种根系分泌物中鉴定到并且在接菌后含量增加，可能与西瓜枯萎病感病有关。关于十八烷酸与D-甘露醇在西瓜枯萎病抗感反应中的作用还有待进一步研究。

抗、感品种的根系分泌物对病原菌生长产生的影响不同。Zhang 等[10]研究发现，在烟草黑胫病中，抗病品种根系分泌物在接菌前后对菌落生长和孢子萌发的抑制率分别为30.00%～46.00%和25.00%～40.00%，感病品种根系分泌物未接菌时对病原菌菌落生长的促进率为7.00%～14.00%，而接菌后有轻微的抑制作用（＜5.00%），但对孢子萌发没有影响。娄晓平等[26]发现，烟草黑胫病中抗病品种根系分泌物对病原菌菌丝生长的抑制率为5.93%～20.78%；感病品种根系分泌物对病原菌菌丝生长的促进率为2.15%～16.47%。李巍等[20]在草莓枯萎病研究中发现，抗病品种根系分泌物对菌丝生长和孢子萌发的抑制率为18.20%～21.40%，感病品种根系分泌物对菌丝生长和孢子萌发的促进率为22.10%～34.50%。抗病品种根系分泌物主要对病原菌菌丝生长、孢子萌发起抑制作用，感病品种根系分泌物起促进作用，并且在棉花黄萎病[27]、烟草青枯病[28]、番茄青枯病[29]上也有类似结论。在笔者的研究中，抗病品种根系分泌物抑制病原菌菌丝生长、孢子萌发与产孢，未接菌抑制率分别为37.02%～77.87%、13.51%～40.54%和17.11%～58.14%，并在接菌后抑制作用增强；感病品种根系分泌物促进病原菌菌丝生长、孢子萌发与产孢，未接菌促进率分别为19.87%～67.11%、21.18%～81.82%和15.38%～72.00%，并在接菌后3～9 d 促进作用增强。接菌后前期根系分泌物对菌丝生长影响较大，后期对孢子萌发与产孢影响较大。

综上，在笔者的试验中西瓜抗感品种根系分泌物中共检测出10 大类、25 种物质，十八烷酸可能与西瓜抗病有关，D-甘露醇可能与西瓜感病有关；抗病品种根系分泌物抑制病原菌菌丝生长、孢子萌发与产孢；感病品种根系分泌物促进病原菌菌丝生长、孢子萌发与产孢，并在接菌后抑制或促进作用增强。