柑橘潜叶甲幼虫中肠细菌的多样性及功能分析

牛营超， 崔立星， 丁 露， 戴小华，2， 郭青云，2

(1.赣南师范大学生命科学学院潜叶昆虫研究组，江西赣州 341000； 2.国家脐橙工程技术研究中心，江西赣州 341000)

昆虫中肠是昆虫进行食物消化吸收的重要场所，栖息于中肠的微生物与寄主昆虫协同进化、互惠共生，对昆虫的生命活动具有重要的影响[1-2]。中肠微生物的群落结构和代谢活动不仅受到宿主昆虫中肠微环境的影响，还在宿主的生长发育、免疫反应、营养代谢、抵御病害和农药抗性等方面发挥着重要作用[1，3-5]。16S rRNA基因文库技术和Illumina MiSeq测序技术极大地推动了昆虫肠道微生物领域的研究。目前，昆虫中肠细菌多样性的研究主要集中在鳞翅目、鞘翅目、等翅目和膜翅目等昆虫中，已经取得不少进展，其优势细菌的种类因昆虫种类而异[6]。

柑橘潜叶甲(PodagricomelanigricollisChen)隶属于鞘翅目(Coleoptera)叶甲科(Chrysomelidae)，是潜食性柑橘害虫，主要分布在我国南部柑橘产地[7]。柑橘潜叶甲于每年4月上中旬孵化成幼虫潜入柑橘类植物叶片中，取食叶片的幼嫩组织，仅留下叶片的上下表皮细胞，且具有转潜道行为，大量暴发时会严重降低叶片的光合作用，进而影响柑橘的产量，造成经济损失[8]。柑橘潜叶甲幼虫，因其潜食在叶片内，药物很难直接接触虫体，防治较为困难。近年来有大量报道显示，肠道微生物可能作为防治害虫的新型靶标，研究者已在此基础上开发出新的防控技术。目前，柑橘潜叶甲的研究主要集中在形态、生理生化和防治上，有关肠道微生物的研究未见报道。本研究选择枳叶片上的柑橘潜叶甲幼虫为研究对象，基于16S rRNA基因的高通量测序技术研究柑橘潜叶甲幼虫中肠细菌的种类组成及多样性，以期为该害虫的防治提供新策略。同时，本研究利用传统微生物培养方法从柑橘潜叶甲幼虫中肠中分离细菌，以期为未来利用生物学试验验证柑橘潜叶甲幼虫中肠微生物的功能提供菌株材料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试昆虫为2021年4月在江西省龙南市柑橘园采集的柑橘潜叶甲幼虫，寄主为枳[Poncirustrifoliata(L.) Raf.]。

1.2 柑橘潜叶甲幼虫中肠的分离及总基因组DNA的提取

取40头柑橘潜叶甲幼虫，饥饿处理48 h后在无菌环境下用75%乙醇对幼虫体表进行3 min的消毒，用无菌水清洗幼虫体表的乙醇3次，使用无菌镊子和眼剪将幼虫中肠取出，置于无菌的1.5 mL EP管内，10头虫的中肠为1个重复，共设3个重复[9]。用Mag-Bind Soil DNA extraction kit(Omega)试剂盒提取柑橘潜叶甲幼虫肠道细菌总DNA，将检测合格的样品于-80 ℃保存备用。

1.3 柑橘潜叶甲幼虫中肠细菌16S rRNA基因的高通量测序

以提取的肠道总基因组为模板，采用通用引物338F(5′-A C T C C T A C G G G A G G C A G C A-3′)、806R(5′-G G A C T A C H V G G G T W T C T A A T-3′)扩增细菌16S rRNA V3～V4区[10]。50 μL PCR扩增体系如下：2 μL基因组DNA模板，0.5 μL TaKaRa LATaqDNA Polymerase，5 μL 10×Buffer，上、下游引物(10 mmol/L)各1 μL，4 μL dNTPs(各2.5 mmol/L)，36.5 μL ddH2O。PCR扩增条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，35个循环；72 ℃ 10 min。PCR扩增反应重复3次。将扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，浓度和特异性合格后送至上海派森诺生物科技股份有限公司进行双端测序(使用Illumina HiSeq 2500平台)。

1.4 生物信息学分析

将测序得到的原始数据用QIIME2(2019年4月)的qiime cutadapt trim-paired切除序列的引物片段，弃去未匹配引物的序列[11-12]；通过调用DADA2进行质控、去噪、拼接、去嵌合体，得到有效序列[13]。用USEARCH(v 7.0.1090)软件在97%的相似度下进行操作分类单元(OTU)聚类，并用Silva数据库对扩增获得的柑橘潜叶甲幼虫中肠细菌16S rRNA序列进行物种注释[14]。用PICRUSt2 KEGG数据库分析柑橘潜叶甲幼虫中肠菌群在第1、2级功能通路水平上的丰度，预测菌群对宿主的潜在功能[15]。

1.5 柑橘潜叶甲幼虫中肠可培养细菌的分离培养

取10头柑橘潜叶甲幼虫，参照“1.2”节的方法取出中肠，置于灭菌的1.5 mL EP管内，加入 100 μL 无菌磷酸缓冲盐溶液(PBS)，用灭过菌的研磨棒将中肠研磨至匀浆状，将研磨好的匀浆用无菌水稀释至10-1～10-6。取稀释度为10-4、10-5、10-6的3个匀浆溶液均匀涂抹至LB培养基(分别称取10 g蛋白胨、5 g酵母提取物、10 g NaCl、20 g琼脂，用蒸馏水定容至1 L，pH值为7.0)上进行分离培养，各稀释度重复3次。将平板于37 ℃培养箱内培养3 d。通过观察菌落的颜色、大小和形态分离纯化单菌落，经多次纯化，得到纯单克隆菌株，保存于-80 ℃备用。

1.6 柑橘潜叶甲幼虫中肠可培养细菌的16S rRNA基因扩增及系统发育分析

用TIANamp Bacteria DNA Kit(DP-302)提取细菌总DNA。采用细菌通用引物27F(A G A G T T T G A T C C T G G C T C A G)、1492 R(C G G T T A C C T T G T T A C G A C)扩增16S rRNA基因[16]。50 μL PCR反应体系：1 μL 基因组DNA，上、下游引物(10 mmol/L)各 2 μL，25 μL PrimeSTAR MAX DNA聚合酶，20 μL ddH2O。扩增程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃ 10 min。扩增结束后用1.0%琼脂糖凝胶进行检测，切取目标DNA条带，用Omega D2500-02 Gel Extraction Kit琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化后测序。将所获序列在NCBI GenBank数据库中进行BLAST同源比对[17]，选取各个菌株的近缘序列，采用最大似然(ML)算法，用MEGA 7.0软件构建系统发育树，用bootstrap验证进化树的可靠性[18]。

2 结果与分析

2.1 高通量测序结果和OTU聚类分析

通过16S rRNA高通量测序，共得到219 003条柑橘潜叶甲幼虫中肠细菌的原始序列，通过质控拼接，共得到203 864条优质序列，序列的平均长度为425 bp。基于97%的相似水平，柑橘潜叶甲幼虫中肠细菌通过聚类分析共获得550个OTU，隶属于11门、21纲、42目、71科、99属。

2.2 柑橘潜叶甲幼虫中肠细菌的种类组成与丰度

基于OTU的分类结果，分别从门、纲、目、科、属5种不同分类等级上对柑橘潜叶甲幼虫中肠菌群种类和相对丰度进行分析。由图1可以看出，在门分类水平上，注释到的优势菌有变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、异常球菌-栖热菌门(Deinococcus-Thermus)、绿弯菌门(Chloroflexi)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、埃普西隆杆菌门(Epsilonbacteraeota)、蓝细菌门(Cyanobacteria)、Patescibacteria等，其中以变形菌门、厚壁菌门、放线菌门和拟杆菌门为优势菌门，相对丰度占比分别为90.83%、4.80%、2.30%和1.04%。

在纲分类水平上，柑橘潜叶甲幼虫中肠菌群由γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)、α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)、梭菌纲(Clostridia)、放线菌纲(Actinobacteria)、芽孢杆菌纲(Bacilli)、拟杆菌纲(Bacteroidia)、丹毒丝菌纲(Erysipelotrichia)、异常球菌纲(Deinococci)、β-变形菌纲(Deltaproteobacteria)、OLB14等21个纲组成。其中γ-变形菌纲、α-变形菌纲是优势菌，占比分别为73.71%、16.97%。

在目分类水平上，柑橘潜叶甲幼虫中肠菌群由肠杆菌目(Enterobacteriales)、根瘤菌目(Rhizobiales)、海螺菌目(Oceanospirillales)、假单胞菌目(Pseudomonadales)、伯克氏菌目(Betaproteobacteriales)、梭菌目(Clostridiales)、黄色单胞菌目(Xanthomonadales)、微球菌目(Micrococcales)、柄杆菌目(Caulobacterales)、丹毒丝菌目(Erysipelotrichales)等42个目组成。其中主要的优势菌群是肠杆菌目，相对丰度占比为53.59%，而根瘤菌目、海螺菌目和假单胞菌目次之，相对丰度占比分别为15.52%、9.28%和5.49%。

在科分类水平上，柑橘潜叶甲幼虫中肠菌群隶属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、德沃斯氏菌科(Devosiaceae)、盐单胞菌科(Halomonadaceae)、根瘤菌科(Rhizobiaceae)、假单胞菌科(Pseudomonadaceae)、伯克氏菌科(Burkholderiaceae)、单胞菌科(Xanthomonadaceae)、丹毒丝菌科(Erysipelotrichaceae)、生丝单胞菌科(Hyphomonadaceae)、消化链球菌科(Peptostreptococcaceae)等71个科。其中主要的优势菌是肠杆菌科，相对丰度占比为53.59%，其次是德沃斯氏菌科、盐单胞菌科、根瘤菌科、假单胞菌科，相对丰度分别为9.73%、9.28%、5.52%、5.14%。

在属分类水平上，柑橘潜叶甲幼虫中肠菌群主要由沙雷氏菌属(Serratia)、Pelagibacterium、嗜盐单胞菌属(Halomonas)、假单胞菌属(Pseudomonas)、欧文氏菌属(Erwinia)、泛菌属(Pantoea)、苍白杆菌属(Ochrobactrum)、苏黎世杆菌属(Turicibacter)、Rosenbergiella、Ralstonia等99个属组成。其中优势菌群为沙雷氏菌属、Pelagibacterium、嗜盐单胞菌属、假单胞菌属，相对丰度占比分别为45.52%、9.73%、9.28%、5.14%。

2.3 柑橘潜叶甲幼虫中肠细菌功能分析

利用PICRUSt2预测柑橘潜叶甲幼虫中肠细菌在KEGG第1、2分类层次功能通路的丰度，其中第1分类层次功能通路有6种，分别为代谢(80.67%)、遗传信息处理(10.03%)、细胞过程(4.98%)、环境信息处理(3.8%)、生物体系统(0.33%)和人类疾病(0.19%)(图2)。由于代谢功能通路对应的丰度占比是一级通路丰度占比的4倍，因此预测柑橘潜叶甲幼虫中肠细菌的主要功能是代谢。柑橘潜叶甲幼虫中肠细菌代谢功能的二级通路共有28种(图2)。各二级通路在全部样本中的占比如下：糖类代谢占14.36%，氨基酸代谢占12.85%，辅助因子和维生素代谢占11.76%，萜类和多酮代谢占8.10%，生物降解和代谢占7.70%，其他氨基酸代谢占7.68%，脂质代谢占6.58%，能量代谢占5.13%，细胞活性占3.21%，糖类生物合成和代谢占2.84%，其他次生代谢产物的生物合成占2.06%。预测柑橘潜叶甲幼虫中肠细菌的功能是代谢体内各种物质，主要参与糖类、氨基酸和维生素的代谢，同时次要参与外源化学物质、萜类和多酮类化合物的降解。

2.4 柑橘潜叶甲幼虫中肠可培养细菌的分离和鉴定

从LB固体培养基中共分离得到5株形状有差异的细菌菌落，分别编号为PN1、PN2、PN3、PN4、PN5。菌落形态均为圆形且边缘整齐，其中PN2、PN4为湿润光滑的乳白色菌落，PN1、PN2、PN5为小的白色菌落。将从柑橘潜叶甲幼虫中肠中分离的5株可培养细菌用通用引物进行16S rRNA扩增，测序后将序列上传至GenBank。将得到的16S rDNA序列在NCBI数据库进行BLAST比对，分析序列的同源性，并构建ML系统发育树(图3)。结果表明，PN2、PN4菌株与沙雷氏菌(Serratia)的亲缘关系最近，聚为1支，鉴定为沙雷氏菌(图3-A)。PN1、PN3和PN5菌株与不动杆菌(Acinetobacter)的亲缘关系最近，聚为1支，鉴定为不动杆菌。从可培养微生物数量来看，以沙雷氏菌为优势菌(图3-B)。

3 讨论与结论

本研究基于16S rRNA和Illumina MiSeq开展了潜食性害虫柑橘潜叶甲幼虫中肠细菌多样性组成分析，共注释到11门、21纲、42目、71科、99属。柑橘潜叶甲幼虫中肠细菌主要以变形菌门(91%)、厚壁菌门(5%)、放线菌门(2%)和拟杆菌门(1%)为主。研究发现，昆虫的肠道共生细菌的优势门虽然存在各式差异，但是变形菌门细菌是肠道的主要菌群之一[19]。如Cui等发现，潜食性昆虫黄黑趾铁甲(Dactylispaxanthospila)成虫肠道细菌主要分为30门、64纲、135目、207科、369属，其中以变形菌门(92%)、拟杆菌门(3.4%)和厚壁菌门(2.5%)为优势菌群[9]。张某等研究发现，专性寄生内食性昆虫泽兰实蝇(Procecidocharesutilis)幼虫肠道细菌注释到13门、4纲、6目、7科、10属，其中变形菌门细菌为优势菌群(99%)[20]。陈宏健等研究发现，鞘翅目昆虫松墨天牛(Monochamusalternatus)成虫中肠细菌主要分为22门、48纲、112目、172科、285属，其中变形菌门为主要优势菌群(93%)[21]。

在属分类水平上，柑橘潜叶甲幼虫中肠细菌以沙雷氏菌属为优势属(45.52%)，该属细菌在许多昆虫肠道中作为优势菌存在，能够帮助宿主昆虫高效降解纤维素、单萜或双萜等物质[22-23]。在已有的其他鞘翅目昆虫研究中，昆虫肠道优势菌属存在物种、虫态差异，如黄黑趾铁甲成虫肠道细菌以肠杆菌属为优势属[9]；国内室内饲养的松墨天牛的成虫中肠细菌以沙雷氏菌属为优势属，室外成虫肠道细菌以肠杆菌属为优势属[21]；寄生于栎属的象甲肠道细菌以假单胞菌属为主[24]。肠杆菌属、沙雷氏菌属属于肠杆菌科变形菌门细菌，普遍存在于动物肠道中，主要在纤维素、碳水化合物等代谢中起作用[25]。

本研究利用传统微生物学分离法对柑橘潜叶甲幼虫中肠细菌进行离体培养时，发现沙雷氏菌为优势菌，其次是不动杆菌，与16S rRNA高通量测序结果一致。沙雷氏菌作为条件致病菌，在很多昆虫如小菜蛾、黄粉虫、椰心叶甲等肠道中被离体培养分离出来[26-28]，该类细菌可能长期参与昆虫的共进化并对昆虫的生命活动有重要作用。不动杆菌具有协助宿主消化食物和转化氮素的功能，该类菌也在蜜蜂、斜纹夜蛾和褐飞虱肠道中分离培养出来[29-31]。柑橘潜叶甲幼虫主要潜食在柑橘类植物叶片里，以叶肉为食，肠道菌群可能受到柑橘植物与土壤微生物的影响，其影响程度和相关性还需进一步通过其他试验进行验证。这些优势肠道细菌的功能值得我们关注和研究，以期能发掘出与柑橘潜叶甲潜食性相关的肠道细菌或特定基因，用于该类害虫的综合防控。

昆虫肠道菌群多样性丰富，许多菌群与宿主昆虫之间相互依赖、协同进化[2]，影响着昆虫的生命活动。本研究还利用PICRUSt2预测柑橘潜叶甲幼虫中肠细菌的潜在功能，结果显示，柑橘潜叶甲幼虫中肠细菌有80%执行代谢功能，主要通过代谢碳水化合物和氨基酸等为寄主提供营养物质，也有参与对外源化学物质、萜类和多酮类化合物及其他次生代谢物质的降解功能，同时肠道菌群也参与宿主遗传信息处理过程。研究结果表明，柑橘潜叶甲肠道细菌多样性丰富，多数菌群不仅参与了营养代谢，还可能帮助宿主昆虫解毒。该研究结果有利于了解内食性潜叶昆虫的生命活动过程，为今后进一步研究和利用肠道微生物开发新型防控技术提供基础。