金线莲袋栽模式有效活性成分研究

林 蔚，曹泽宇，刘 怡，蔡宗鑫，何碧珠，3，郭梨锦

（1.福建农林大学林学院，福建 福州 350002；2.福建农林大学园艺学院，福建 福州 350002；3.兰科植物保护与利用国家林业与草原局重点实验室 福建 福州 350002；4.福建农林大学资源与环境学院 福建 福州 350002；5.国际镁营养研究所，福建 福州 350002）

金线莲[Anoectochilus roxburghii（Wall.）Lindl]是我国传统珍贵药材，属国家二级保护植物，为兰科（Orchidaceae）开唇兰属（Anoec tochilus）多年生草本植物[1]，主要分布在福建、浙江、广西、广东、四川、云南、江西、湖南、海南、台湾等地[2]。金线莲具有极高的食药用、观赏价值，在治疗急慢性肝炎、糖尿病、高血压、心脏病、肾炎等方面具有较好的疗效[3]，因此市场需求量不断剧增。金线莲之所以具有多种功效是因为其具有多种活性成分，如多酚、黄酮、多糖、有机酸及挥发油等。

传统设施大棚及林下平地种植金线莲种苗，成活率在40%以下，病虫害严重，农药使用量大，品质差，成品保存率在35%以下，产品质量难以保障，直接影响农户收获效益。且种植地域受限局限于我国南部，严重制约金线莲产业健康持续发展。采用袋栽方式繁殖金线莲，生长持续时间可达480 d以上，比平地栽培持续时间延长300 d以上，实现封闭袋内开花结果；产量提高2倍以上；全生育期没有病虫害、无需使用农药及人工浇灌管理，产品质量安全有保障；成活率高，在96%以上，持续生育期长，成品保存率高达95%，品质可控制，效益显著。

目前有研究证实，采收期对果蔬与药材品质具有显著的影响[4]，但关于金线莲不同采集时间活性成分的比较研究极少[5]。而系统研究金线莲不同采集时间活性成分变化规律具有重要的生产指导意义。因此文中对袋栽金线莲不同采集时间活性成分的变化规律进行了分析比较，探讨影响袋栽金线莲药用成分变化的主要因素，以期为金线莲袋栽培奠定理论依据，并为其生产种植采收提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

袋栽金线莲，来源于漳州合作企业“红霞”组培品种（图1）。

图1 袋栽金钱莲

1.2 试剂与仪器

试剂：香草醛、冰乙酸、高氯酸、齐墩果酸、无水乙醇、硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠、苯酚、浓硫酸、石油醚、氯仿、甲醇、蔗糖、苦参碱、三氯甲烷、β-豆甾醇、金线莲苷、醋酐等；仪器：Lambda 25紫外/可见光光谱仪。

1.3 试验方法

1.3.1 生物学性状。对5种栽培时长袋栽金线莲进行采集，解剖，对叶、茎、根进行生物学性状测量，拍摄金线莲的各个部位的整体、局部、解剖照片，随机挑选3株进行生物学性状及生物量调查。软尺测量茎高（顶芽抽出处至茎基部长度），数显游标卡尺测量茎粗（茎最粗处直径大小）。选取植株最大展开叶片，用软尺测量叶长及叶宽。计算植株叶片数，并测定单株鲜重及干重。单株鲜重为单株材料清洗干净并擦拭干水分后称重所得；单株干重为测定鲜重后于50℃烘箱烘干至恒重。用Avantes可携带式光谱仪进行反射率、颜色的测定，记录，整理，用函数运算形成颜色模型构建的坐标数据。

1.3.2 试验材料预处理。取新鲜的金线莲样品，先用流水清洗干净，后用蒸馏水润洗，121℃烘箱烘干至恒重，研磨成粉末，过目筛，得金线莲干燥粉末，密封低温贮存备用。样品烘干，研磨后用于金线莲总黄酮、多糖、生物碱、甾醇、总三萜等含量的测定，每份样品作3次重复。

1.3.3 活性成分测定。

1.3.3.1 总三萜含量测定：精确称取金线莲样品0.3 g，置2 mL离心管中，加600μL 70%乙醇，振荡混匀，超声500 W，30 min，静置10 min，超声重复1次。离心8 000 rpm，5 min。取上清液转至刻度管。沉淀加600μL 70%乙醇，超声，离心，取上清液。上清液用70%乙醇定容至50 mL。取0.2 mL乙醇提取液，挥干溶剂，加0.3 mL 5%香草醛-冰乙酸溶液，然后加1 mL高氯酸，于60℃反应20 min，冰浴10 min，加10 mL冰乙酸稀释，在波长550 nm处测定吸光值。

5%香草醛-冰乙酸溶液的配制：准确称取香草醛1.25 g，迅速用适量冰乙酸溶解，转入25 mL的容量瓶中，用冰乙酸定容，以备当日之用。

总三萜标准曲线的制作：精确称取齐墩果酸对照品10 mg，以无水乙醇为溶剂，定容至50 mL，得终浓度为0.2 mg/mL。精确吸取齐墩果酸标准溶液：0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于试管中，挥干溶剂。加0.3 mL 5%香草醛-冰乙酸溶液，然后加1 mL高氯酸，于60℃反应20 min。冰浴10 min，加10 mL冰乙酸稀释，在波长550 nm处测定吸光值。

1.3.3.2 总黄酮测定：精确称取金线莲样品0.3 g，置2 mL离心管中，加600μL 70%乙醇，振荡混匀。超声500 W，30 min，静置10 min，超声重复1次。离心8 000 rpm，5 min。取上清液转至20 mL刻度管。沉淀加600μL 70%乙醇，超声，离心，取上清液。重复该步骤1次。上清液用70%乙醇定容至50 mL。取2 mL溶液置于20 mL刻度管，70%乙醇定容至4 mL，加5%NaNO2和10%Al（NO3）3溶液各0.3 mL摇匀，静置5 min，加3 mL 4% NaOH溶液，30%的乙醇定容至10 mL，混匀静置5 min。分光光度计510 nm处，比色。

总黄酮标准曲线：精确称取干燥芦丁对照品10 mg，加70%乙醇定容至50 mL，得终浓度为0.2 mg/mL芦丁标准液。取芦丁标准液0、1、2、3、4、5 mL至刻度试管，分别加0.3 mL 5% NaNO2溶液，摇匀；加0.3 mL 10% Al（NO3）3溶液，摇匀；静置5 min，加2 mL 4% NaOH溶液，摇匀。在加70%乙醇定容至10 mL显色5 min，在510 nm波长下测定吸光值。

1.3.3.3 总多糖测定：采用苯酚-硫酸法，参照曾碧玉等[10]所述方法。精确称取金线莲样品0.15 g，置10 mL离心管中，加5 mL的双蒸水，沸水浴90 min。置离心机常温，10 000 rpm，离心5 min，取上清液转至20 mL刻度管。沉淀加1 mL双蒸水，沸水浴，离心，取上清液，该步骤重复1次。双蒸水漂洗残渣，离心，取上清液。上清液用双蒸水定容置50 mL。加5 mL石油醚于溶液中，台式恒温振荡器常温200 rpm，10 min。静置分层，弃上层溶液。下层溶液加氯仿：正丁醇（5∶1）溶液2 mL，混匀至乳浊状，静置分层。取50μL上层溶液置20 mL离心管中，双蒸水定容至2 mL。加1 mL 9%苯酚溶液，摇匀。加5 mL浓硫酸，摇匀。室温下静置30 min，分光光度计485 nm处比色。

多糖标曲的制作：精确称取蔗糖干燥样品10 mg，去离子水定容100 mL，分别取0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mL加水定容至2 mL，再依次加1 mL 9%苯酚溶液，摇匀，然后加5 mL浓硫酸摇匀。待冷却至室温，以空白为对照，在485 nm波长下比色测定吸光值。

1.3.3.4 总生物碱测定：精确称取金线莲样品0.3 g，置2 mL离心管中，加600μL甲醇，振荡混匀。超声100 W，70℃，40 min，静置10 min，超声重复1次。离心8 000 rpm，5 min。取上清液转至20 mL刻度管。沉淀加600μL甲醇，超声，离心，取上清液。重复该步骤1次。上清液用甲醇定容至50 mL。取甲醇提取液0.5 mL、pH 5.6柠檬酸钠缓冲液7 mL、溴麝香草酚蓝2 mL置于分液漏斗中，氯仿萃取3次，每次7.5 mL，每次振荡60 s、静置30 min后过滤，取氯仿层并合并萃取液，取萃取液0.5 mL，加入4.5 mL甲醇进行10倍稀释，稀释液于418 nm测定OD值。

溴麝香草酚蓝指示剂：取溴麝香草酚蓝0.1 g，加0.05 mol/L NaoH（0.02 g/10 mL）溶液3.2 mL使其溶解，再加蒸馏水稀释至200 mL即得。

总生物碱标曲的制作：称取苦参碱10 mg于50 mL容量瓶中，以甲醇盐酸溶液（100∶1）定容，配成0.2 mg/mL溶液备用。分别吸取0.5、1、1.5、2.0、2.5 mL，于分液漏斗中，随后加入pH 5.6柠檬酸钠缓冲液7 mL、溴麝香草酚蓝2 mL，氯仿萃取3次，每次15 mL，每次振荡60 s、静置30 min后过滤，取氯仿层并合并萃取液。空白组随行，于418 nm测定OD值。

1.3.3.5 总甾醇测定：精确称取金线莲样品0.15 g，置10 mL离心管中，加600μL石油醚，振荡混匀。超声500 W，30 min，静置10 min，超声重复1次。离心8 000 rpm，5 min。沉淀加600μL石油醚，超声，离心，取上清液。重复该步骤1次。上清液用三氯甲烷定容至25 mL。精密量取4 mL，加人醋酐2 mL，浓硫酸20μL，摇匀，显色40～60 min后，于678 nm测定。

总甾醇标曲的制作：精确称取60℃减压干燥至恒重的β-豆甾醇对照品20.0 mg，置10 mL量瓶中，加入三氯甲烷适量使溶解，并稀释至刻度，摇匀，精确量取0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 mL，分别置10 mL量瓶中，用三氯甲烷稀释至刻度，摇匀，分别精 密量取4 mL，加入醋酐2 mL，浓硫酸20μL，摇匀，显色40～60 min后，于678 nm测定。

1.4 数据分析

采用Excel 2010软件对数据进行统计

2 结果与分析

2.1 不同袋栽时长金线莲生物学性状

金线莲袋栽时长生物学性状如表1、图2所示。最大叶长、叶宽和最长的根长是3个月袋栽金线莲，分别为5.25、4.16、10.13 cm；12个月袋栽金线莲的株高、真叶数和根直径最大，分别为15.83、9、0.3 cm，1个月袋栽金线莲茎节间长最长，为8.94 cm，6个月袋栽金线莲茎粗最大，为0.48 cm。

图2 不同袋栽时长金钱莲生育期形态

随着移栽时间的延长，单株鲜重及干重呈先上升后下降趋势。从表1可以看出1个月的袋栽金线莲干重和鲜重最低，分别为1.23和5.43 g。12个月袋栽金线莲的干重和鲜重最高分别为1.45和7.78 g。

表1 不同袋栽时长金线莲生物学性状

2.2 不同袋栽时长金线莲活性成分含量变化

2.2.1 总三萜含量变化。不同袋栽时长金线莲总三萜含量呈先上升后下降再上升的趋势（图3），可以看出，9个月最低，到12个月时，总三萜含量升至0.047 mg/g，达到最高。

图3 不同袋栽时长金线莲总三萜含量变化

2.2.2 总黄酮含量变化。不同袋栽时长金线莲总黄酮含量如图4所示，可以看出，随着移栽时间延长，黄酮含量先降后升再下降。3个月黄酮含量最低；9个月黄酮含量最高（0.034 mg/g），3个月与12个月黄酮含量之间无显著差异。

图4 不同袋栽时长金线莲总黄酮含量变化

2.2.3 总多糖含量变化。不同袋栽时长金线莲总多糖含量呈先下降后上升的趋势（图5），可以看出，1个月多糖含量较高，为0.476 mg/g；随后多糖含量随着移栽时间延长而下降，6个月最低；到9个月时，多糖含量升至0.492 mg/g，达到最高。

图5 不同袋栽时长金线莲总多糖含量变化

2.2.4 生物碱含量变化。袋栽金线莲不同移栽时长总生物碱含量呈先上升后下降的趋势如图6所示。1个月袋栽金线莲总生物碱含量最低，随着移栽时间延长，生物碱含量先上升，6个月袋栽金线莲总生物碱含量最高（0.157 mg/g），后来逐渐下降。

图6 不同袋栽时长金线莲总生物碱含量变化

2.2.5 总甾醇含量变化。不同袋栽时长金线莲的总生甾醇含量如图7所示，可以看出，随着移栽时间延长，总生甾醇含量先上升后下降。1个月总生甾醇含量最低，9个月总生甾醇含量最高（0.997 mg/g）。

图7 不同袋栽时长金线莲总甾醇含量变化

3 讨论

本试验通过对5种栽培时长袋栽金线莲进行采集和生物学性状测量，测得3个月袋栽金线莲叶长、叶宽和根长最大，分别为5.25、4.16、10.13 cm；12个月袋栽金线莲的株高、真叶数和根直径最大，分别为15.83、9、0.3 cm，1个月袋栽金线莲茎节间长最长，为8.94 cm，6个月袋栽金线莲茎粗最大，为0.48 cm。1个月袋栽金线干重和鲜重最低，分别为1.23和5.43 g。12个月袋栽金线莲的干重和鲜重最高，分别为1.45和7.78 g。邵清松等[6]通过对以13份金线莲种质为研究对象，对其9个性状进行相关、通径和主成分分析，可将金线莲形态学性状分为“高产型形态决定因子”和“产量的叶部决定因子”，认为在进行金线莲高产种质创新时，应将株高、叶片鲜重和叶片数作为首要选择指标，然后再对其他性状进行选择，以达到种质改良的目的。

多糖及黄酮是金线莲的重要活性成分，二者的含量是评价金线莲品质的重要指标[7]。金线莲多糖具有提高机体免疫力的作用，在降血糖、保护肝脏、抗炎及抗肿瘤等方面均有显著疗效，具有很高的开发价值[8]。三萜类成分齐墩果酸是常用于治疗急性黄疸性肝炎和慢性肝炎且不良反应较少的药物[9]。黄酮类成分具有多种生物活性，主要有槲皮素、鼠李素、山奈酚的衍生物，大多具有抗氧化自由基作用。生物类黄酮对心脑血管疾病有治疗和保护作用，还具有降血压、降血脂、抗菌、抗肿瘤、抗氧化自由基、提高机体免疫力、镇咳、镇痛等药理活性[10-11]。生物碱是中草药中重要的有效成分之一，有显著的生物活性。朱善岚等[12]利用液质联用技术，首次在金线莲中发现了石杉碱甲和乌头碱，并测定了其含量，认为石杉碱甲与异亮石松碱（Isoselagine）骨架相似，为金线莲在抗阿尔茨海默病方面研究及在临床镇痛方面的利用提供了理论依据。甾醇是以环戊烷多氢为骨架的天然醇类化合物，具有消炎、降低胆固醇的作用[13]。

该试验中，袋栽金线莲总三萜含量以12个月最高，达到0.047 mg/g；9个月袋栽金线莲的黄酮、多糖、生甾醇含量最高分别为0.034、0.492、0.997 mg/g；6个月袋栽金线莲总生物碱含量最高达到0.157 mg/g。因此，结合生物量和活性成分的变化趋势，认为移栽9个月或12个月为袋栽金线莲最佳采收期。