miRNA-19b 在老年慢性阻塞性肺疾病急性加重相关肺动脉高压患者血浆中的变化及其临床价值

张青，熊伟，刘明，张诚实，崔栋慧，冯契靓，赵云峰

1. 上海市浦东新区浦南医院呼吸内科，上海 200125；2. 上海交通大学医学院附属新华医院呼吸与危重症学科，上海 200092

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease， COPD）是常见的一种呼吸道慢性疾病，我国流调数据显示COPD 患病率占40岁以上人群的14.1%［1］，肺动脉高压（pulmonary hypertension， PH）是COPD 常见并发症，我国由COPD 导致的肺动脉高压占60%，大大增加了患者的病死率。 目前临床常用的检测肺动脉高压的无创方法是多普勒超声心动图，三尖瓣峰值流速＞3.4 m·s-1可诊断为肺动脉高压［2］，超声心动图诊断轻度、中度、重度肺动脉高压的标准为：轻度 PH［36 mmHg （1 mmHg ＝0.133 kPa） ＜ 肺动脉收缩压≤50 mmHg）］、中度 PH（51 mmHg ＜ 肺动脉收缩压 ＜70 mmHg）、重度 PH（肺动脉收缩压≥70 mmHg）［3］。

微小 RNA（microRNA， miRNA）是短链非编码RNA，在血清中稳定表达。 miRNA 参与广泛的生理及生物过程，包括细胞增殖、分化、凋亡、代谢、血管生成、淋巴结转移、基因调控、免疫规避等［4-7］，在包括COPD、PH 等肺部疾病炎症、血管重塑过程的诸多方面也发挥重要作用。 miR-17-92 基因簇为一种典型的含有多顺反子启动子的高度保守的基因簇，位于人染色体 13q31.3 处，包含 7 个成员：miR-17-3p、 miR-17-5p、 miR-18a-5p、 miR-19a-3p、 miR-19b-3p、 miR-20a-5p 和 miR-92a-3p。 在动物模型中， miR-17-92 基因簇参与了低氧诱导下的肺动脉高压的形成。 Chen 等［8］研究发现，平滑肌细胞特异性敲除miR-17-92 的小鼠能减弱缺氧诱导的肺动脉高压，而重建miR-17-92 能够恢复平滑肌细胞特异性敲除miR-17-92 的小鼠缺氧诱导的肺动脉高压。 研究发现血浆中miRNA-19b 参与了肺动脉高压的形成［9］，但是在慢性阻塞性肺疾病急性加重期（AECOPD）相关肺动脉高压患者中未见相关报道，本研究旨在探讨血浆miRNA-19b 在AECOPD 相关肺动脉高压患者中的临床价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取上海市浦东新区浦南医院呼吸科病房2020年11月—2021年11月诊治的 AECOPD患者。 纳入标准： （1）入组患者均符合慢性阻塞性肺疾病急性加重（AECOPD） 诊治中国专家共识 （2017年更新版）制定的 AECOPD 标准［10］； （2）患者年龄≥60岁； （3）签署知情同意书。 符合以上全部标准的病例纳入本研究。 排除标准： （1）肺栓塞、慢性血栓栓塞性肺动脉高压、下肢深静脉血栓； （2）肺间质纤维化、糖尿病、肝功能不全、肾功能不全； （3）恶性肿瘤；（4）冠心病，心功能不全等； （5）研究者认为不宜纳入本项研究的特殊人群。 具备以上任意1 项标准的病例不纳入本研究。 采用超声心动图诊断轻度、中度、重度肺动脉高压［3］。 本研究经浦南医院伦理委员会批准通过（批准号为PNYY2020-19）。

本研究对象分2 组，分别为 AECOPD 组（A 组，n＝45）、 AECOPD 合并 PH 组（B 组，n＝111）；再根据肺动脉收缩压（PASP）结果将B 组分为轻度肺动脉高压组（B1 组，n＝43）、中度肺动脉高压组（B2 组，n＝36）、重度肺动脉高压组（B3 组，n＝ 32）共 3 个亚组。A 组中男 31例，女 14例，中位年龄 69.5岁；B 组中男71例，女 40例，中位年龄 72.7岁。 亚组中 B1 组中男28例，女 15例，中位年龄 69.5岁； B2 组好男 23例，女 13例，中位年龄 73.4岁； B3 组中男 20例，女 12例，中位年龄76.2岁。 性别构成比、年龄在以上组间比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。

1.2研究方法

1.2.1 超声心动图测定肺动脉收缩压 应用Philip IE33 超声诊断检测仪在彩色多普勒引导下测定肺动脉收缩压。 探头频率 2.5 ～3.5 MHz，患者在静息状态下取仰卧位或者左侧卧位，平静呼吸，先后在胸骨旁左室长轴、心尖左室长轴切面、心尖四腔或五腔、动脉根部短轴、左室短轴及右室流出道长轴等切面进行探查。 测量各房室大小，大血管内径，室间隔及左、右室厚度，观察各室壁运动情况、瓣膜结构、活动情况以及有无异常的血流方向及速度，探查有无心脏畸形。对合并三尖瓣反流患者，取右室流出道为标准切面，利用连续多普勒测量三尖瓣最大反流速度（V），用简化柏努利方程计算三尖瓣跨瓣压差。 将测得的三尖瓣跨瓣压差加上右房压即为PASP。 若未合并三尖瓣反流者，可利用连续多普勒测定其分流频谱的收缩期最大分流速度，计算 PASP［3］。

1.2.2 血浆 miR-19b 、IL-6 水平测定 所有研究对象于入院次日晨起空腹抽取静脉血10 mL，取6 mL静置后送至检验科生化室检测；取4 mL 室温静置30 min后， 4 ℃ 下 3 000 r／min 离心 10 min，提取血浆，移入Eppendorf 管，置于 -80 ℃冰箱保存待测。血浆miRNA-19b 测定：采用定量反转录聚合酶链反应（qRT-PCR）测定 miR-19b。 按 Trizol 试剂盒说明书步骤提取细胞总RNA 并测定其浓度。 通过反转录获得cDNA，以cDNA 为模板进行PCR 扩增。 Caspase-3：正义链 5ˊ-GAATCCACGAGCAGAGTCAA-3ˊ，反义链 5ˊ-TAGCCTTCAACAAGCCAACC-3ˊ； β-actin：正义链 5ˊ-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3ˊ， 反 义 链 5ˊ-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3ˊ。 反应条件： 94 ℃变性5 min， 95 ℃ 15 s， 60 ℃ 30 s（收集荧光信号）， 40个循环；72 ℃ 10 min。 在扩增 miR-19b 的同时，扩增U6RNA（管家基因）作为内参照，结果以 2-ΔΔCt法表示［11］。 血浆 IL-6 测定：应用 ELISA 试剂盒（上海酶联生物科技有限公司生产）依照说明书操作方法对血浆IL-6 进行检测。

1.2.3 6 分钟步行距离的测定 在病房内用米尺事先测定30 m 距离，标明起始点位置，每5 m 标注数字，记录患者6 分钟所行走的距离。 在6 分钟内患者如果出现疲乏、头晕、心前区疼痛、呼吸困难、出冷汗、面色苍白则停止实验。 试验前后记录患者血压、心率、呼吸频率。 6 分钟步行距离分4 个等级，≥350 m 为轻度、 250～349 m 为中度、 150 ～249 m 为重度、≤149 m 为极重度，级别越低说明心肺功能越差［12］。

1.3 统计学分析应用SPSS 19.0 统计学软件进行数据分析。 计量资料以均数±标准差（）表示，组间比较行独立样本t检验，组内比较用配对样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析；计数资料以例数和百分率表示，组间比较采用χ2检验；相关性分析采用直线相关性分析。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组肺动脉收缩压、血浆miRNA-19b、血浆IL-6、血浆CRP、NT-ProBNP 比较表 1 结果显示， A、B 组两两比较，肺动脉收缩压、血浆miRNA-19b、血浆IL-6、血浆CRP、血浆 NT-ProBNP 各指标之间的差异均有统计学意义（P均 ＜ 0.05）； B1、 B2、 B3 组两两比较，上述各指标之间的差异，均有统计学意义（P均 ＜0.05）。

表1 各组研究对象肺动脉收缩压及血浆miRNA-19b、血浆IL-6 、CRP 、NT-ProBNP 水平的比较（ ）

表1 各组研究对象肺动脉收缩压及血浆miRNA-19b、血浆IL-6 、CRP 、NT-ProBNP 水平的比较（ ）

注： 与 A 组比较， *P ＜0.05；与 B1 组比较， ＃P ＜0.05；与 B2 组比较， ▲P ＜0.05。

组别 肺动脉收缩压（mmHg） 血浆miRNA-19b 血浆IL-6（pg·mL-1）血浆CRP（mg·L-1）血浆NT-ProBNP（pg·mL-1）A 组 （n ＝45） 32.3 ±6.7 2.527 ±0.621 32.3 ±10.3 41.2 ±12.6 279.3 ± 65.5 B 组 （n ＝ 111） 60.4 ±15.6* 1.468 ±0.421* 64.1 ±16.4* 60.4 ±17.5* 771.6 ± 168.8*B1 （n ＝ 43） 47.1 ±12.5 1.825 ±0.413 51.7 ±17.8a 49.6 ±14.4a 517.3 ± 103.2a B2 （n ＝36） 62.3 ±16.7＃ 1.411 ±0.372＃ 66.3 ±21.2＃ 62.3 ±20.3＃ 803.5 ±217.7＃B3 （n ＝32） 76.2 ±21.3＃▲ 1.052 ±0.293＃▲ 78.3 ±22.6＃▲ 72.7 ±13.8＃▲ 1077.5 ±277.5＃▲

2.2 各组动脉血气和6 分钟步行距离的比较表2结果显示， A、B 组两两比较， pH 值、 PaO2、PaCO2、6分钟步行距离各指标之间的差异，均有统计学意义（P均 ＜0.05）； B1、 B2、 B3 组两两比较，上述各指标之间的差异，均有统计学意义（P均 ＜0.05）。

表2 各组动脉血气和6 分钟步行距离的比较（）

表2 各组动脉血气和6 分钟步行距离的比较（）

注： 与 A 组比较， *P ＜0.05；与 B1 组比较， ＃P ＜0.05；与 B2 组比较， ▲P ＜0.05。

组别 pH PaO2（mmHg） PaCO2（mmHg） 6 分钟步行距离（m）A 组 （n ＝45） 7.31 ±0.48 54.6 ± 11.8 55.3 ±12.6 319.6 ±89.8 B 组 （n ＝ 111） 7.27 ±0.42* 42.8 ± 14.1* 62.5 ±14.6* 244.1 ±71.8*B1 （n ＝ 43） 7.34 ±0.77 49.7 ± 13.8 52.7 ±8.1 285.6 ±77.6 B2 （n ＝36） 7.27 ±0.61＃ 40.3 ±8.9＃ 62.5 ±9.9＃ 237.8 ±69.6＃B3 （n ＝32） 7.22 ±0.61＃▲ 36.3 ±9.2＃▲ 75.3 ±15.7＃▲ 195.3 ±51.7＃▲

2.3 相关性分析表3 结果显示， A、 B 两组研究对象血浆miRNA-19b 与肺动脉收缩压、血浆IL-6、血浆CRP、血浆 NT-ProBNP、PaCO2均呈负相关性（P均 ＜0.05）、与 pH 值、 PaO2、 6 分钟步行距离均呈正相关性（P均 ＜0.05）； B1、 B2、 B3 3 组研究对象血浆 miRNA-19b 与肺动脉收缩压、血浆IL-6、血浆 CRP、血浆NTProBNP、 PaCO2均呈负相关性（P均 ＜0.05）、与 pH 值、PaO2、 6 分钟步行距离均呈正相关性（P均 ＜0.05）。

表3 各组血浆miRNA-19b 与其他指标值的相关性

3 讨论

PH 的发病机制主要是缺氧、炎症等各种原因引起的细胞增殖、凋亡，导致肺上皮细胞和内皮细胞损伤功能失调、肺血管重塑。 miR-17-92 簇是控制细胞发育、凋亡和增殖的最具特征的miRNA 家族之一。miR-17-92 基因簇上调可导致细胞凋亡的减少（尤其是抗缺氧诱导的细胞凋亡）和细胞增殖增加。 在缺氧所致肺动脉高压和动脉性肺动脉高压中， miR-17-92簇表达受P53 负调控，受原癌基因转录因子（C-myc）和IL-6／STAT3 通路正向调控，从而导致miR-17-92 簇靶目标 HIF1α 或 BMPR2 的升高或降低。 P53 介导的miR-17-92 的下降被认为是缺氧介导的细胞凋亡复杂过程中的一部分，在缺氧条件下， miR-17 和miR-20a的抑制也会导致明显的细胞凋亡［13］。 miRNA-17-92簇对右心室收缩压和肺血管重构也有作用。 抗miRNA-17-92 可降低右心室收缩压和肺血管重构。 Pullamsetti 等［14］在低氧诱导的肺动脉高压鼠模型中，抗miRNA-17 治疗明显减少右心室收缩压和总肺血管抵抗，增加肺动脉加速时间，恢复心输出量，减少肺血管重塑。 miRNA-19b 是 miR-17-92 基因簇中的 1 个成员，参与了肺动脉高压的形成［9］、与 IL-6、TNF-α 等参与肺动脉高压形成的炎症因子有关［15］。 研究发现血浆IL-6、血浆NT-ProBNP 与COPD 肺动脉高压密切相关，血浆NT-ProBNP 水平增高不代表患者一定存在心功能不全，而是存在肺动脉高压［16］。

本研究结果显示：A、B 组两两比较以及B1、B2、B3 组两两比较，血浆miRNA-19b、肺动脉收缩压、血浆IL-6、 血 浆 CRP、 血 浆 NT-ProBNP、 pH 值、 PaO2、PaCO2、6 分钟步行距离各指标之间的差异，均有统计学意义。 A、 B 组研究对象以及 B1、 B2、 B3 组，血浆miRNA-19b 与肺动脉收缩压、血浆 IL-6、血浆 CRP、血浆 NT-ProBNP、 PaCO2均呈负相关性，与 pH 值、PaO2、6 分钟步行距离均呈正相关性。 以上研究结果说明：合并肺动脉高压的 AECOPD 老年患者血浆miRNA-19b 水平明显低于不合并肺动脉高压的AECOPD 老年患者；在AECOPD 相关PH 老年患者中，随着肺动脉压力逐渐增高，血浆miRNA-19b 水平逐渐降低，上述情况具体机制不详，分析原因可能血浆miRNA-19b 表达受P53 负调控，与缺氧介导的肺上皮细胞和内皮细胞损伤、凋亡的复杂过程关系密切。

综上所述，在AECOPD 相关PH 老年患者中，随着肺动脉压力逐渐增高，血浆miRNA-19b 水平逐渐降低，血浆miRNA-19b 水平与AECOPD 相关PH 老年患者病情严重程度存在一定的关系。 本研究不足之处是单中心研究，样本量较小，需要以后进行多中心和大样本研究。 另外，动态监测AECOPD 相关PH 老年患者血浆miRNA-19b 的水平可能对辅助诊断AECOPD 合并PH 有一定的临床价值。