微小RNA与常染色体显性遗传性多囊肾病关系的研究进展*

许丽丽 综述，陈 婷，黄文辉 审校

(1.甘肃中医药大学第一临床医学院/甘肃省人民医院，甘肃 兰州 730000； 2.甘肃省人民医院肾内科，甘肃 兰州 730000)

常染色体显性遗传性多囊肾病(ADPKD)是成人中最常见的单基因遗传性肾病。据2020年中国ADPKD临床实践指南报道，ADPKD患病率为1/2 500～1/1 000，中国有125万例患者，大约一半的患者在60岁时进展为终末期肾病,被认为是终末期肾病的第四大原因[1-2]。主要表现为双侧肾囊肿进行性发展和扩大，并伴有肾小球滤过率降低、高血压、肝囊肿、脑动脉瘤等[3]。迄今为止，ADPKD的治疗主要包括拮抗血管加压素受体(托伐普坦)、支持措施(控制血压、增加液体摄入量、限盐和戒烟)及必要时肾脏替代治疗等[4]，尚缺乏特异性治疗药物。近年来，越来越多的微小RNA(miRNA)被发现在包括多囊肾(PKD)在内的肾脏发育中存在差异表达，可通过影响关键生长因子或相关信号通路参与肾脏发育过程[5]。因此，研究miRNA在ADPKD发病中的作用对ADPKD生物标志物的确定及治疗靶点的选择具有重要意义。现将目前已知的miRNA与ADPKD的关系综述如下。

1 ADPKD发病机制

目前，ADPKD发病机制仍未完全明确，公认的发病机制有纤毛致病假说、螺旋区-螺旋区相互作用假说、“二次打击”假说等，最近有研究表明，表观遗传学(组蛋白修饰、DNA甲基化及翻译后修饰)改变同样可促进ADPKD的发生、发展。ADPKD发病机制：(1)ADPKD主要由编码多囊蛋白1(PC1)和PC2的PKD1(16p13.3)和PDK2(4q21)基因突变所致，PKD1是一种多结构域糖蛋白并在G蛋白偶联受体蛋白水解位点被剪切，PKD2属阳离子钙调节通道的瞬时受体电位家族的一种蛋白，80%的患者通过突变的PKD1和15%的患者通过突变的PKD2基因发展为ADPKD，其余5%的发病机制可能涉及其他基因的突变[6]。(2)纤毛致病假说。有研究表明，肾纤毛由肾小管上皮细胞深入肾小管腔，与尿液直接接触，主要功能是作为机械感受尿流刺激，PC1、PC2均位于初级纤毛(一种在机械转导中具有重要作用的顶端触角状细胞器)上并形成多囊蛋白复合体，将机械刺激转化为化学信号传递给细胞,二者中任意一种缺失均会使初级纤毛功能异常，造成细胞内钙和环磷酸腺苷(cAMP)水平的变化，以及随后的雷帕霉素靶蛋白(mTOR)和Wnt等信号通路改变，最终导致细胞增殖和液体分泌异常，囊肿形成和生长[7]。(3)螺旋区-螺旋区相互作用假说。PC1、PC2借助C端螺旋区相互作用,成为ADPKD发病的共同途径，并且PC1的稳定表达可能依赖于PC2的存在[8]。(4)“二次打击”假说。囊肿始于正常肾小管，PKD1或PKD2的生殖系突变导致一个等位基因的丢失，而体细胞的第2次打击导致另一个正常等位基因的丢失，随后肾毒性损伤和(或)缺血在内的一个或多个途径导致囊肿发生作为“第3次打击”，导致肾小管细胞增殖，引起扩张及形成大小不等的充满液体的囊肿[9]。(5)表观遗传学。表观遗传调控有2种主要形式：①组蛋白乙酰化，组蛋白去乙酰化酶(HDACs)是PKD基因的调节因子和(或)参与囊肿发生的信号通路，在肾上皮细胞中HDAC5已被确定为PKD1依赖的液体压力感应的靶点，PKD1蛋白产物多囊素促进钙离子流入细胞，并促进HDAC5蛋白激酶C磷酸化[10]，HDAC6在PKD1突变小鼠肾细胞中上调，抑制HDAC6通过降低细胞内cAMP和Ca2+水平抑制囊肿细胞生成[11]；②DNA甲基化，2014年WOO等[12]报道了ADPKD患者样本DNA甲基化水平，发现基因组中有13 000多个不同甲基化片段，91%为高甲基化的，基因组外显子区是ADPKD DNA甲基化变化的主要靶点，高甲基化促进囊肿的发生。进一步研究表明，ADPKD患者整个组织中生成的差异甲基化片段主要反映在单个ADPKD囊肿的甲基化组中[13]；③翻译后修饰，miRNA翻译后修饰可改变基因表达的相关生物学机制，与ADPKD的关系将在后文介绍。除上述之外，还提出了钙信号通路缺陷、终止信号假说、齐-杂合子学说等。另外，囊肿形成和扩张本身伴随着炎症、巨噬细胞活化、缺血、细胞因子产生和肾小管阻塞等，这些可能进一步促进了囊肿形成和生长的环境，即所谓的“滚雪球”效应[14]。迄今为止，ADPKD很多发病机制尚未明了，仍需通过进一步研究发掘。

2 miRNA的发现、形成及功能

miRNA是一类内源性小非编码 RNA (19～25个核苷酸)，具有保守性、组织特异性和时序性,调控包括发育时间、造血、脏器发育、细胞凋亡、细胞增殖，甚至可能是肿瘤发生等多种途径[15]。1993年第1个miRNA在秀丽新小杆线虫体内中被发现[16]，迄今为止，约2 300个人类成熟miRNA被报道，其中1 115个在miRNA数据库被标注[17]，在健康或疾病状态下几乎所有生物途径均受到miRNA的调控。miRNA的形成大致包括以下步骤：(1)大部分miRNA基因在细胞核中被RNA聚合酶Ⅱ转录生成长链初级miRNA(pri-miRs)；(2)Pri-miRs被核糖核酸酶Ⅲ型核酸内切酶及双链RNA结合蛋白处理形成茎环结构的Pri-miRs；(3) Pri-miRs被输出蛋白5转运至细胞质,被另一种核糖核酸酶Ⅲ型核酸酶处理成为成熟双链RNA；(4)双链miRs分子中的引导链被选择性加载到AGO中形成miRNA诱导的沉默复合物，而另一条过客链从AGO中释放并被降解；(5)miRNA诱导的沉默复合物根据miRNA引导链的种子序列，对靶miRNA进行翻译抑制或降解，从而发挥生物学效应[18]。miRNA是体内平衡的关键调节因子，其失调是引起ADPKD在内的多种疾病的基础,因此，miRNA可能是ADPKD有前途的诊断生物标志物和潜在的治疗靶点。

3 miRNA在ADPKD中的作用机制

3.1miR-17～92与ADPKD miR-17～92是一种进化上保守的多顺反子miRNA簇，是最具特征的miRNA癌基因之一，主要位于人类基因组C13orf25的800碱基对区域，由非蛋白编码基因MIR17HG编码的7 kb转录本生成；根据种子序列同源性，miR-17～92可分为4个家族，即miR-17 (miR-17-5p和miR-20a)、miR-18、miR19(miR-19a和19b-1)和miR-92 (miR-92-1)，还包括2个旁系同源簇，即miR-106b～25和miR106a～363)[19]。miR-17～92具有促进增殖、逃避凋亡反应，以及抑制分化、增加血管生成和维持细胞存活等功能[20]，与ADPKD的发生密切相关。有研究表明，miR-17～92在Kif3a-KO小鼠、Pkhd1-/-小鼠、Pkhd1/cre；Pkd2F/F等多个PKD小鼠模型表达上调，并在miR-17～92过表达小鼠肾脏中观察到肾小管扩张、肾小管囊肿和肾小球囊肿，这些效应可能与miR-17～92通过促进增殖、PKD基因(PKD1、PDK2)和肝细胞核因子-1β的转录后抑制来介导，因此，特异性失活miR-17～92可抑制囊肿的生长，改善肾功能，延长生存期[21]。通过抑制miR-17～92可能是ADPKD的一种有效的治疗方法。 MiR-17是miR-17～92中的一种促增殖miRNA，目前已在真核生物中得到广泛研究，被认为是ADPKD的一个有价值的药物靶点。有研究表明，在PKD1、PKD2敲除的小鼠模型和ADPKD患者肾囊肿样本中miR-17表达上调，且 PKD2的 3′非翻译区(3′UTR)比PKD1更具保守性；在HEK293细胞中miR-17可直接靶向作用于PKD2的3′UTR，通过转录后抑制PKD2基因表达，促进囊肿细胞增殖[22]。HAJARNIS等[23]研究表明，miR-17基因缺失会抑制囊肿增殖和PKD进展，其原因可能是改善了线粒体功能，在ADPKD小鼠模型中miR-17可被原癌基因cMyc靶向激活，直接作用于过氧化物酶体增殖剂激活受体α(PPARα)抑制氧化磷酸化和脂肪酸氧化基因表达，最终调节线粒体代谢，促进ADPKD发展；抗miR-17及PPARγ激动剂可抑制PKD小鼠模型的囊肿生长，说明由cMyc-miR-17-PPARα信号轴诱导的促增殖代谢途径是ADPKD发病机制之一。目前，RGLS4326是一种miR-17短寡核苷酸抑制剂，已被证实可通过抑制miR-17的PKD1、PKD2等多个靶点以减弱囊肿生长，并在体外ADPKD模型和多个PKD小鼠模型中显示出良好的稳定性、安全性、药代动力学和药效学特点[24]。因此，miR-17及其靶点对ADPKD的治疗至关重要。

3.2miR-21与ADPKD miR-21是最早被识别的miRNA之一，由位于染色体17q23.2上的液泡膜蛋白1基因编码，进化保守的miR-21在高细胞增殖、抗凋亡、高侵袭和转移潜能相关癌细胞中高度表达，因此，miR-21也被认为是一种致癌基因[25-26]。LAKHIA等[27]研究表明，miR-21表达上调是啮齿动物和人类PKD的共同特征，囊肿上皮细胞是miR-21水平升高的主要来源；在ADPKD直系同源小鼠模型中cAMP可通过激活PKA促进cAMP反应元件结合蛋白(CREB)与miR-21启动子靶向结合，进而促进PKD的发生、发展，miR-21基因缺失抑制囊肿发展。另外，程序性细胞死亡因子4(PDCD4)是miR-21的新靶点，miR-21可通过直接抑制PDCD4而抑制囊肿上皮细胞凋亡。其中CREB在肾囊肿发生过程中具有关键作用[28]。因此，cAMP/CREB-miR-21-PDCD4信号轴可能成为ADPKD的一个新的药物干预途径。一项循环miRNA作为ADPKD患者生物标志物的研究对ADPKD患者根据慢性肾脏病(CKD)分期进行分类发现，miR-21在内的8个miRNAs表达水平随肾小球滤过率下降至少增加2倍[29]，为循环miRNA预测ADPKD疾病进展提供了理论依据，但尚需更多的研究进一步证实。

3.3miR-132-3p 与ADPKD 氧化应激在ADPKD发病早期发挥了核心作用,促进囊肿的生长机制可能与一氧化氮合成不足、内皮功能障碍和粒体功能障碍有关[30]。miR-132在小鼠、人类、苍蝇及其他具有类似结构和序列的物种中均具有保守性，人体内miR-132由17号染色体上的hsa-miR132-5p和hsa-miR-132-3p组成，miR-132-3p是miR-132/212的重要组成部分，对人体不同系统之间的生理平衡至关重要[31]。miR-132-3p作为miR-132的剪接变体，被证明直接靶向并负向调控叉头框O3(Foxo3)，进而抑制炎性反应和凋亡[32-33]。Foxo3是叉头框转录因子家族的一员，参与了细胞代谢、细胞氧化还原、细胞增殖等过程，是已知的氧化应激反应的关键调节因子[34]。CHOI等[35]通过 PKD1选择性基因敲除小鼠miRNA测序和ADPKD患者基因芯片分析发现，miR-132-3p在小鼠和人类ADPKD中均显著表达，是Foxo3a的关键调控因子，有趣的是，在ADPKD线粒体中甘氨酸脒基转移酶(Gatm)基因表达被下调，miR-132-3p过表达可抑制Foxo3并降低Gatm的表达，从而导致氧化应激，促进ADPKD的囊肿生长，因此，miR-132-3p-Foxo3a-Gatm信号轴在ADPKD中的氧化应激发挥着关键作用，miR-132-3p的进一步研究对ADPKD早期诊断和防治具有重要意义。

3.4miR-182与ADPKD 肌动蛋白细胞骨架异常是ADPKD的一个显著特征[35,37]。最近一项研究表明，ADPKD中肌动蛋白细胞骨架和囊肿的发生存在直接联系，这是一种新的信号传导机制,并受miR-182-5p的调控，miR-182-5p在野生型Pkd1f/f 模型小鼠髓质区和肾小球中表达，并在小鼠饲养的第7天观察到miR-182-5p表达于囊肿上皮细胞中；另外，在PKD1缺陷小鼠模型肾囊肿上皮细胞中肌动蛋白细胞骨架减少和紊乱，其标记基因Wiskott-Aldrich综合征蛋白家族成员2、胞质分裂作用因子1和 整合素α4表达水平均显著降低，miR-182-5p过表达靶向抑制肌动蛋白细胞骨架标记物及肌动蛋白细胞骨架的组织，特别是板粒的形成，最终促进囊肿生长[38]。因此，miR-182-5p可能通过调节肌动蛋白细胞骨架，成为一种新的诱导因子在ADPKD中发挥关键作用。SUN等[39]也发现，miR-182在Pkd1-/-小鼠模型中较对照组显著增加，同时，转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的ADPKD囊肿上皮细胞中Smad3 蛋白表达明显增加；在囊肿上皮细胞中转染miR-182模拟物后未受TGF-β1诱导的ADPKD囊状上皮细胞miR-182表达上调，TGF-β1诱导的ADPKD囊肿上皮细胞中miR-182表达更高，提示miR-182通过TGF-β1/Smad3通路抑制PKD肾纤维化的分子机制。TGF-β1是纤维化过程中的一个关键的促纤维化生长因子，调节细胞增殖、分化和凋亡，而miR-182的表达与TGF-β1诱导的纤维化呈正相关[40]。由此可见，miR-182在ADPKD发生、发展中扮演着重要角色。

3.5miR-214与ADPKD miR-214由一种名为Dnm3os的反义非编码RNA编码，最初被发现可促进宫颈癌细胞凋亡，在人类肾脏疾病和动物肾脏疾病模型中高表达[41-42]。巨噬细胞可促进囊肿的形成和发展，清除PKD小鼠肾脏中的巨噬细胞可显著降低囊性指数及囊壁细胞增殖，并改善肾功能[43]。LAKHIA等[44]研究表明，miR-214及其宿主长非编码RNA Dnm3os在小鼠和人ADPKD中稳定且持续表达，囊肿微环境中的间质细胞是miR-214主要来源；另外，miR-214具有抑制囊肿相关炎症和致病性MRC1+巨噬细胞积聚的作用，尽管miR-214的基因缺失并不影响肾脏发育或体内平衡，但在PKD2-和PKD1-突变小鼠中抑制miR-214会加重囊肿的生长，其机制是Toll样受体4(TLR4)/干扰素-γ/重组人信号传导与转录激活因子1促炎通路激活miR-214，反过来，miR-214作为一个负反馈环直接抑制TLR4，表明miR-214的缺失与TLR4表达增加和囊肿巨噬细胞积累增强相关。因此，miR-214表达水平的上调是囊肿微环境的代偿性保护反应，其功能是抑制炎症和囊肿生长，但miR214在ADPKD中的作用尚需进一步确定。

3.6miR501-5p与ADPKD mTOR信号通路或机制靶点参与了ADPKD囊肿的形成和扩大过程,在许多PKD患者的16号染色体上PKD1基因和邻近的 结节性硬化症基因2(TSC2)基因缺失,且PKD1基因和TSC1或TSC2基因杂合突变小鼠比单基因突变小鼠出现更多的肾囊肿[45]。DE STEPHANIS等[46]在ADPKD细胞和组织中观察到磷酸酶张力蛋白同源物(PTEN)和TSC1基因表达水平降低，mTOR磷酸化水平及miR501-5p表达水平显著升高。PTEN和TSC1是mTOR的上游效应分子，二者同时敲除小鼠比TSC1单基因突变体小鼠发生更严重的PKD[47]。DE STEPHANIS等[46]研究进一步表明，PTEN和TSC1的3′UTR包含miR501-5p的多个识别位点,miR501-5p的上调可导致PTEN和TSC1表达水平降低,进而激活mTOR激酶；另一方面，mTOR激酶的激活诱导癌基因MDM2的上调，导致肿瘤抑制蛋白——p53的泛素化和降解，从而促进细胞增殖并抑制凋亡，最终影响ADPKD的发展。同样在肾癌细胞中也观察到miR501-5p通过增强mTOR活性导致p53失活，促进细胞增殖和存活[48]。因此，miR501-5p及其信号途径可为ADPKD的治疗药物靶点提供新选择。

3.7其他miRNA与ADPKD 在ADPKD组织和细胞系中miR-199a-5p显著上调，并随疾病进展而增加，抑制miR-199a-5p表达可抑制囊肿细胞增殖及诱导细胞凋亡，经确认周期蛋白依赖激酶抑制因子1C是miR-199a-5p的直接靶点，miR-199a-5p可能通过靶向周期蛋白依赖激酶抑制因子1C/p57发挥作用[49]。KOCYIGIT等[29]根据CKD分期对80例ADPKD患者进行分组发现，循环中miR1260a、miR-1587、miR-21-5p、miR-3907、miR-3911、miR-92a-3p 均出现剂量反应现象，并随着肾小球滤过率下降至少增加2倍；随访1年后比较了所有患者所选变量与进展结果的关系发现，肾小球滤过率估计值下降大于10%与年龄、CKD分期和miR-3907独立相关。另外，在ADPKD患者中提取尿液外泌体miRNA发现了7个肾脏富集的miRNA，即miR-194-2簇(miR-1925p和miR-194-2-5p)、miR-194-1-5p和miR-30家族的4个成员(miR-30a-5p、miR-30b-5p、miR-30d-5p和miR-30e-5p)的表达低于健康对照组，这些miRNA在晚期ADPKD患者中的表达均有显著变化，而在早期ADPKD患者中只有miR-194-1-5p、miR-194-2-5p的表达显著低于对照组[50]。近年来，miRNA与自噬的关系也得到研究，有研究证实，miR-25-3p在PKD小鼠中上调，抑制miR-25-3p可通过调控自噬相关蛋白14促进PKD小鼠细胞自噬，抑制细胞增殖[51]。

4 小 结

ADPKD是肾衰竭常见且难以治愈的病因之一，近年来，越来越多的miRNA被发现在ADPKD中异常表达，并与其发生、发展密切相关，因此，本文就相关miRNA与ADPKD发病机制的关系进行了综述，旨在为治疗ADPKD的靶点选择提供一些线索。但目前大多数miRNA只在动物及细胞实验中进行了研究，尚未在临床中得到验证；此外，仍有许多miRNA的功能及机制在ADPKD中尚未明确,因此，未来尚需要大量的研究探索miRNA在ADPKD发生、发展中的作用，以发掘ADPKD的潜在生物标记物及治疗靶点。