表达木质素降解酶的基因工程产朊假丝酵母菌部分生物学特性研究

高 娃， 其布日， 萨初拉， 苏少锋， 吴青海， 呼 和*， 郁 彭

（1.天津科技大学生物工程学院，天津 300457；2.内蒙古自治区农牧业科学院，内蒙古呼和浩特 010031）

内蒙古有着丰富的秸秆资源，全区年产各类农作物秸秆达35亿千克，相当于全区天然草原打草量的2倍（高雪峰等，2015）。但目前秸秆营养成分利用率低、适口性差、应用价值不高，因此只有小部分作为饲料，其余大部分直接还田或焚烧，导致资源浪费和环境污染。秸秆用作饲草利用率低的原因：一是随着农作物的成熟，木质化程度越高，秸秆细胞壁中木质素含量增加。木质素因其与半纤维素分子之间形成的网状结构而增加了细胞壁对微生物 的 抵 抗 能 力 （Nat han Mosier等，2005；SahaBadal，2003）。由于防止了反刍动物瘤胃微生物水解酶与细胞壁中纤维素和半纤维素的接触，这一结构特性也达到降低纤维多糖的降解效率（Ding等，2012）。玉米秸秆中木质素含量为19%～23%，是限制秸秆有效利用的最主要物质（Michelin等，2011；杨世关等，2006；马靓等，2005；杨淑慧，2001）。二是目前已开发应用的微波预处理、热水处理、氨纤维爆炸、蒸汽爆破、酸处理、碱处理等，这些预处理方法能提高秸秆利用率，但实际应用中无法满足高价的设备条件（Ahmed等，2016）。

自然界中能够降解木质素的只有少数微生物，其中绝大部分是真菌（Lun等，2010），少数是细菌（Yang等，2007），但细菌的木质素降解能力很弱（陈跃辉，2013）。本研究中对前期构建的表达木质素降解酶的2株重组产朊假丝酵母菌-ZHMX4和ZHQX1的菌株部分生物学特性进行研究，包括木质素降解酶适宜反应条件、木质素降解酶基因拷贝数和重组产朊假丝酵母菌降解天然木质素能力的测定以及重组产朊假丝酵母菌营养需要分析等，全面了解重组产朊假丝酵母菌特性的同时为后续研究工作奠定基础。

1 材料和方法

1.1 菌株、试剂及培养基

1.1.1 菌株、质粒及载体 黄孢原毛平革菌，Phanerochaete chrysosporium（BNCC 190652），云芝栓孔菌，Trametes versicolor（BNCC 145690）：北纳创联生物技术有限公司；产朊假丝酵母（31395）：中国工业微生物菌种保藏管理中心；ZHMX4和ZHQX1：本实验室构建保存。

1.1.2 试验材料Sapphire芯片：法国Stilla Technologies公司；纤维素酶：和氏璧生物科技公司；半纤维素酶：浙江一诺生物科技公司，Biolog YT微孔板，无菌水接种液：BIOLOG公司；

1.1.3 培养基及溶液 酵母浸出粉胨葡萄糖（YPD）液体培养基：酵母提取物1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，加蒸馏水定容，121℃、15 min高压灭菌，备用。YPD固体培养基：YPD液体培养基中添加2 %的琼脂粉（Agar），灭菌备用。马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）：9.76 g PDA，加水定容至200 mL，高压灭菌，备用。甘油培养基：2%甘油，2%蛋白胨，1%酵母浸粉，2%琼脂。产酶培养基：葡萄糖10 g，酒石酸铵0.1 g，KH2PO40.2 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，MnSO40.035 g，CuSO4·5H2O 0.007 g，加水至1 L，121℃灭菌20 min。50 mmol/L的琥珀酸缓冲液（pH 4.5）：0.81 g琥珀酸钠定容至100 mL水中。称0.59 g琥珀酸，用配好的琥珀酸钠将pH调到4.5。0.4 mmol/L的愈创木酚：0.04 mmol（4.5 μL）愈创木酚，用1 mL 95%的乙醇溶解。20 mmol/L H2O2：230 μL H2O2用水定容至100 mL。10 mmol/L藜芦醇：71 μL藜芦醇用水定容至50 mL。50 mmol/L的酒石酸缓冲液（pH 3）：0.75 g酒石酸，用水定容至100 mL；0.97 g酒石酸钠定容至100 mL水中，向酒石酸溶液中添加酒石酸钠至pH 3.0。

1.2 工程菌木质素降解酶基因拷贝数测定dPCR技术是将指数信号转为数字信号的一种新的核酸定量方法（Vogelstein等，1999）。将总模板PCR反应体系分液，分许多单独的PCR反应进行扩增，检测有无荧光信号来计算拷贝数。后经泊松统计学处理，最后得出样品DNA/RNA的浓度（Pinheiro等，2012；Sanders等，2011；Hindson等，2011）。相比qPCR技术，该技术无需建立标准曲线，直接定量核酸拷贝数，对低浓度的样品定量更准确。具体的操作按NaicaTMCrystal Digital PCR System的快速操作指南进行。反应体系（25 μL）：样本2 μL，PCR mastermix 5 μL，Alexa FluorTM 647（25×）1 μL，上下引物各1 μL，EvaGreen（20×）2 μL，Nuclease-free water 13 μL。扩增条件：95℃5 min，95℃15 s，55℃15 s，共45个循环，72℃30 s。

1.3 工程菌木质素降解酶适宜反应条件的测定

1.3.1 最适pH用不同pH的缓冲液，在30℃下反应，测得工程菌经甘油诱导后的粗酶液最高活力pH。

1.3.2 最适反应温度 用最适pH的缓冲液，分别在20、30、40、50、60、70℃测定酶活力，测得最适反应温度。

1.3.3 酶活测定 过氧化物酶的酶活测定：采用以黎芦醇（VA）为底物的测定方法。1 mL 50 mmol/L的酒石酸缓冲液（pH 3），500 μL 10 mmol/L藜芦醇，1 mL粗酶液，30℃温浴10 min后，加入20 μL 20 mmol/L H2O2溶液启动反应，测反应最初3 min内310 nm处吸光值的变化。以不加H2O2的酶液为对照进行试验。漆酶的酶活测定：采用愈创木酚法。缓冲溶液常用琥珀酸钠溶液，终浓度为50 mmol/L。缓冲溶液的pH为4.5。底物愈创木酚的终浓度为0.4 mmol/L。反应温度为30℃，反应时间为30 min。测定465 nm处OD值变化。以沸水中煮2～5 min的酶液为对照进行试验。酶活计算公式如下：

式中：V为反应体积，mL；t为反应时间，min；Va为酶液体积，mL；ε为消光系数，过氧化物酶ε：3.6×104（mol/L）-1cm-1，漆酶ε：9.3×103（mol/L）-1cm-1。

1.4 工程菌木质素降解酶降解秸秆木质素能力的测定 （1）取100 g玉米秸秆装入真空袋内，待用。（2）取适量浓度的微生物过夜培养物（OD600±1.8）至上述含有玉米秸秆的袋内，迅速混匀。晒干的秸秆+菌液+无菌水的比例，按表1所示添加，无菌水添加以72%的比例充分混合于袋中，添加量为109cfu/g。（3）利用真空封口机抽真空，封口。（4）室温放置11 d，测量木质素降解率。每组试验重复3次。（5）检测方法：按GB/T 20805-2006操作。

表1 各组组合和添加量

1.5 工程菌营养需求分析 本试验采用Biolog微生物细胞表型芯片（PM）技术分析ZHMX4和ZHQX1菌株细胞生长的代谢特点、营养物质的需求，从而对工程菌的培养工艺进行了优化。

Biolog YT微孔板通过微生物对微孔板中的不同碳源的利用及氧化情况进行测试，测试使得有特征代谢的孔变成紫色，从而使微生物在测试板上显示出“代谢指纹图谱”。所有必要的营养物质以及生化试剂都被预先填充、干化在96个孔中。在一部分孔中（A~C行），四唑类氧化还原染料通过色度的变化来指示碳源的氧化情况。而剩下的孔（D~H行）则通过浊度的变化来显示微生物对碳源的利用情况。试验操作按照Biolog YT MicroPlateTM的说明书进行。在YPD固体培养基上划线培养ZHMH4和ZHQX1，制成47%T细胞浓度的菌悬液，YT板内每孔添加100 μL菌悬液后孵育。在孵育后的24、48、72 h，用Biolog系统进行数据采集和比对。

2 试验结果

2.1 工程菌木质素降解酶基因拷贝数测定 用dPCR技术定量ZHMX4和ZHQX1 2株工程菌的拷贝数，拷贝数分别为4.84和24.3，结果见图1和表2所示。

图1 工程菌ZHMX4和ZHQX1微滴式dPCR的一维散点图

表2 dPCR试验结果

2.2 工程菌木质素降解酶酶学性质的研究

2.2.1 ZHMX4最适pH由表3可知，ZHMX4最适反应pH为3.0，将ZHMX4置于不同pH缓冲溶液中于30℃保温2 h，结果表明该酶在pH 3.0～5.0稳定性较好，在pH高于6.5的条件下，ZHMX4基本失活。

表3 ZHMX4最适pH测定结果U/L

2.2.2 ZHMX4最适温度 由表4可知，将ZHMX4置于不同温度保温2 h，当温度低于30℃和高于70℃时，酶活力基本丧失。ZHMX4的最适反应温度为30℃。2.2.3 ZHQX1最适pH由表5可知，ZHQX1最适反应pH为4.5，将ZHQX1置于不同pH缓冲溶液中于30℃保温2 h，结果表明该酶在pH 4.0～5.0稳定性较好，在pH高于6.0的条件下，ZHQX1的酶活逐渐降低。

表4 ZHMX4最适温度测定结果U/L

表5 ZHQX1最适pH测定结果U/L

2.2.4 ZHQX1最适温度 由表6可知，将ZHQX1置于不同温度保温2 h，当温度低于30℃和高于70℃时，酶活力基本丧失。ZHQX1的最适反应温度为30℃。

表6 ZHQX1最适温度测定结果U/L

2.3 工程菌木质素降解酶降解秸秆木质素能力的测定 对照组为未加任何菌株和试剂的秸秆样品；A组为ZHMX4和ZHQX1菌液各2 mL混合发酵的秸秆样品；B组为ZHMX4和ZHQX1菌液各5 mL混合发酵的秸秆样品；C组为把两株工程菌各2 mL混合，再加入适当剂量的纤维素酶和半纤维素酶发酵的秸秆样品；D组为把两株工程菌各5 mL混合，再加入适当剂量的纤维素酶和半纤维素酶发酵的秸秆样品。试验中两株菌的菌液浓度为（OD600～1.8）。结果见表7。

表7 发酵试验结果

未加任何菌株和试剂的秸秆（对照组）的酸性洗涤木质素含量为8.3%，A组样品的酸性洗涤木质素含量为4.16%。B组样品的酸性洗涤木质素含量为4.2%。与对照组相比较，A组和B组均显著降低（P<0.05）。A组与B组无差异显著性（P>0.05），说明，随着添加量的增大，其降解木质素的能力基本无变化。C组样品酸性洗涤木质素含量为5.1%。D组样品的酸性洗涤木质素含量为4.73%。酸性洗涤木质素含量均比未添加纤维素酶和半纤维素酶的A组和B组的含量高，差异显著（P<0.05）。说明添加纤维素酶和半纤维素酶对工程菌降解秸秆木质素有阻抗作用。这可能是因为工程菌+纤维素酶+半纤维素酶同时进行酶解和发酵时，木质素降解产生的酚类物质（Duarte等，2012；Du等，2010；朱均均等，2009）抑制了纤维素酶的水解（Zakaria等，2015；Kim等，2011；Ximenes等，2011）。

2.4 工程菌营养需求分析

2.4.1 ZHMX4的营养需求分析 如图2所示，A12、B1、B3、B4、C1、C2孔内的底物被ZHMX4氧化，变成紫色。考虑工程菌ZHMX4的培养基优化中可添加菊粉、D-纤维二糖、麦芽糖、麦芽三糖、N-乙酰基-D葡萄糖胺、a-D-葡萄糖等营养物质，将会对该工程菌ZHMX4的生长有促进作用。

图2 ZHMX4的YT板数据

2.4.2 ZHQX1的营养需求分析 如图3所示，A12、B3、B10、C2孔内的底物被工程菌ZHQX1氧化，变成紫色。考虑工程菌ZHQX1的培养基优化中可添加菊粉、麦芽糖、蔗糖、a-D-葡萄糖等营养物质，将会促进该工程菌ZHQX1的生长。

图3 ZHQX1的YT板数据

3 讨论

当前绝大多数秸秆还是以简单的粉碎、压成颗粒及青贮制作方式饲喂家畜。奶牛对简单加工玉米秸秆中的干物质（DM）表观消化率为63.38%，中性洗涤纤维（NDF）表观消化率为62.06%，酸性洗涤纤维（ADF）表观消化率为50.36%（徐学博等，2015）。肉牛对简单粉碎小麦秸秆中的中性洗涤纤维表观消化率为56.87%，酸性洗涤纤维表观消化率为49.04%（李振，2013）。即秸秆饲料饲喂当中，至少有近37%的干物质、38%～46%的中性洗涤纤维、49%～51%酸性洗涤纤维经粪便流失掉。在中国玉米种植面积较大、产量多，会产生大批玉米秸秆，而其中只有20%的玉米秸秆被有效加工（刘东等，2018）。所以，攻克秸秆饲料消化利用率的关键技术是解决我区畜牧业生产中粗饲料资源不足和利用率低，降低养殖成本，提高牛、羊饲养数量和养殖经济效益的有效途径。

白腐真菌能高效并选择性降解木质素。已知白腐真菌分泌几种与木质素降解相关的酶，即木质素过氧化物酶（LiP）、漆酶（Lac）、锰过氧化物酶（MnP）、多功能过氧化物酶（Heinfling等，1998）和多种辅助酶。多数分泌1～2种降解木质素的酶（Trap等，2013；Zyani等，2009），也有少部分白腐菌可分泌3种降解木质素的酶，说明降解木质素并非4种酶都参与（Wei Wang等，2015）。研究表明，这几种木质素降解酶的降解机制是均能与低分子质量中介体共同作用，产生具有攻击木质素结构的中间产物，引起木质素氧化反应，从而导致木质素的降解（池玉杰等，2007）。

白腐真菌生长周期长、酶活低，不利于工业化生产。为了提高过氧化物酶的产量，很多研究（宁娜等，2017；刘晓庆等，2016；李阿敏等，2015）利用基因工程技术对白腐真菌的多个过氧化物酶基因进行克隆和异源表达。高效的异源表达更适合工业化生产的需求。陈建军等（2018）以黄孢原毛平革菌为模板，利用同源重组技术扩增漆酶基因，将其表达在大肠杆菌中，漆酶酶活提高了近39%。孙亚范（2004）将木质素过氧化物酶基因在毕赤酵母中表达，木质素过氧化物酶酶活提高了122.1%。王娇（2014）将锰过氧化物酶基因在毕赤酵母中表达，木质素降解率提高了31.38%。因毕赤酵母表达系统研究较成熟，木质素过氧化物酶基因在毕赤酵母中表达的研究较多（裴佐帝等，2014；Gu等，2014；范芳芳，2013；包文华，2012；Wang等，2004）。但是，毕赤酵母不是食品级微生物，它的应用受到限制。

产朊假丝酵母被FDA认证为食品级酵母，可运用于食品、饲料及制药业中（Kondo，等，1995）。若将木质素降解酶基因转化到产朊假丝酵母中，并应用于发酵秸秆，可破坏木质素的包裹作用，使纤维素和半纤维素暴露出来，利于瘤胃微生物降解和利用秸秆饲料；可以作为安全的单细胞蛋白，改善秸秆饲料中的营养成分含量；其发酵产品不必经过分离纯化，省时且经济实惠。通过产朊假丝酵母异源表达木质素降解酶，也是为提高其产量，为工业化生产奠定基础。

工程菌ZHMX4和ZHQX1是分别从黄孢原毛平革菌和云芝栓孔菌中扩增出Lip基因和Lac基因，利用同源整合重组技术构建所得的工程菌。本研究对前期构建的2株工程菌进行了一系列菌株特性研究，包括木质素降解酶适宜反应条件、木质素降解酶基因拷贝数和工程菌降解天然木质素能力的测定及工程菌营养需要分析，全面了解2株重组产朊假丝酵母菌特性的同时为后续研究工作奠定基础。

4 结论

本试验结果表明，2株工程菌ZHMX4和ZHQX1的拷贝数分别为4.84和24.3；工程菌ZHMX4产木质素过氧化物酶最适反应温度为30℃，最适反应pH为3.0。当pH高于6.5、温度低于30℃或高于70℃时，木质素过氧化物酶基本失活；工程菌ZHQX1产漆酶最适反应温度为30℃，最适反应pH为4.5。当pH高于6.0、温度低于30℃或高于70℃时，逐渐丧失漆酶酶活；菌株一定比例（各2 mL）混合发酵时，秸秆木质素含量降低了4.14 %，木质素降解率达到50.12%，再增加添加量时降解能力基本无变化；Biolog YT微孔板试验结果显示，在工程菌的培养基中添加一些营养物质，对工程菌的生长有促进作用，根据实验结果可对培养基进行优化。