基于生物网络探究愈溃凉血颗粒治疗溃疡性结肠炎的作用机制❋

姜 璐，陈 婷，郭良清，郭 栋△

(1.山东中医药大学第一临床医学院，济南 250011；2.山东中医药大学附属医院，济南 250011；3.山东中医药大学，济南 250355)

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是一种特发性的慢性炎症性肠道疾病，其病变通常起于直肠，逐渐向近端结肠延伸，可累及整段结肠[1-3]，严重者可能会出现皮肤、肝脏、眼睛或关节的肠外表现[4]。该病可能在任何时间和所有年龄出现，但主要的发病年龄在15～30岁之间达到峰值[5]。UC的治疗目前多通过局部或全身性类固醇或氨基水杨酸制剂等经典疗法缓解急性炎症，在中度至重度UC中，硫唑嘌呤或6-巯基嘌呤甚至环孢素A、他克莫司的免疫抑制有助于维持缓解，对于无法通过经典疗法缓解的患者，多通过生物学方法治疗，如抗肿瘤坏死因子制剂(英夫利昔单抗、阿达木单抗以及戈利木单抗)[4,6]。但是，药物治疗失败者和因长期炎症状态需要手术治疗者仍可达15%[7]。据统计，到2025年，UC在全球的流行率预计将影响到3000万人[8]。

中医学认为UC以大肠湿热证最为多见，大肠湿热证多为脾胃中焦虚弱而无以运化，水谷失运日久而生湿，湿邪易挟热，湿热蕴结肠道日久而致肠道黏膜受损，而湿热蕴结日久又可使气血失和，故见下利赤白相间脓血、腹痛泄泻。故治疗常需气血兼顾、攻补兼施，注重寒热共济，方可气调血安，清热利湿而不伤正气，邪去则正安。愈溃凉血颗粒(yu kui granules, YKG)是由白头翁汤和乌梅丸、黄芩汤加减结合临床药物疗效化裁而成，主治以下痢脓血、里急后重为临床特点的厥阴热毒血痢。

网络药理学从生物分子网络的角度研究药物和疾病的作用机制[9-11]，利用网络药理学可以将计算、实验和临床研究相结合，为探索中草药的特性并联系现代科学技术的前沿。故本文以网络药理学方法为研究手段，对YKG治疗UC的具体作用机制进行分析挖掘，为YKG的进一步临床及实验研究提供理论证据。

1 材料与方法

1.1 相关数据库与软件

主要包括中药系统药理数据库及分析平台(TCMSP，https://www.tcmspw.com/)、UniProt数据库(http://www.uniprot.org/)、人类基因数据库(GeneCards，https://www.genecards.org/)、功能性蛋白质联合网络数据库(STRING，https://string-db.org/)、cytoscape 3.7.2软件和DAVID 6.8数据库(https://david.ncifcrf.gov/)[12]。

1.2 槐花散化合物及靶点的鉴定

通过TCMSP数据库检索该方中组成中药药物成分白头翁、黄连、白及、地榆、黄柏、秦皮、乌梅、炮姜、肉桂、黄芪、白芍、椿皮、黄芩、炙甘草14味中药的有效化合物。口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%和类药性(drug-likeness，DL)≥0.18是YKG在化合物筛选过程中必须遵循的条件[12]，获取YKG的有效化合物后，将所得到的化合物通过TCMSP数据库进一步得到其对应的作用靶点。将所获靶点通过UniProt数据库进行标准化名称转换。通过Cytoscape 3.7.2软件建立“YKG-所含化合物-对应靶点”网络。

1.3 UC的靶基因数据库的获取

关键词(key word)是“ulcerative colitis”，从GeneCards中获取与UC有密切联系的靶基因。

1.4 YKG与UC共同靶点的蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction, PPI)的网络构建

将YKG与UC的作用靶点做映射处理，筛选后得到的靶点被视为YKG治疗UC的预测靶点，然后导入STRING数据库，获取它们之间的关系数据，导入Cytoscape 3.7.2，构建YKG与UC的PPI网络，进一步通过Cyto NCA插件实施网络拓扑分析。

1.5 富集分析

将所获YKG与UC的共同靶点导入DAVID 6.8数据库，进行京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)通路富集分析和基因本体论(gene ontology, GO)分析，其中GO分析主要通过对生物学过程(biological process, BP)、细胞组成部分(component of cell, CC)、分子功能(molecular function, MF)的分析来完成。在Image GP网站和Microsoft Excel 2010软件对分析结果进行可视化处理。

2 结果

2.1 YKG的成分、靶点及UC靶点筛选结果

以OB≥30%、DL≥0.18为筛选标准将从TCMSP数据库获取的化合物进行筛选(其中肉桂以DL≥0.14为筛选标准)共获得YKG中209个化合物。进一步得到对应靶点160个，160个靶点主要与187个化合物有关(见表1)，并构建含有YKG的14味中药187个化合物160个靶点的中药-化合物-靶点的网络图(见图1)。此外，在GeneCards数据库中共获得了4622个与UC密切相关的靶点。

表1 愈溃凉血颗粒(YKG)的化合物信息表

2.2 YKG-UC的PPI网络

对上述所获YKG的160个靶点以及UC的4622个作用靶点做交叉映射处理，最终得到90个YKG-UC的共同靶点(如图2)。通过STRING获取90个靶点的基础数据后导入Cytoscape 3.6.2，构建一个含有90个节点的PPI网络(如图3-a)。由于网络涉及节点较多，进一步以CytoNCA插件进行拓扑分析，根据中介中心性(betweenness centrality，BC)>5.15、接近中心性(closeness centrality，CC)>0.54、度值(Degree)>20为筛选标准，筛选出45个靶点(见图3-b)，构建45个靶点的PPI网络，并进一步根据BC>7.33，CC>0.74，Degree>29为筛选标准，在45个靶点中筛选出23个核心靶点，并依照核心靶点的Degree大小绘制PPI网络(见图3-c)。通过PPI网络最终发现抑癌基因P53(tumor suppressor gene P53,TP53)、转录因子和蛋白(transcription factors and proteins, JUN)、前列腺素内过氧化物合酶2(prostaglandin endoperoxide synthase 2，PTGS2)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)、基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2，MMP2)、表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)、白介素2(interleukin 2, IL-2)等靶点的度值处于较高水平，所以本研究认为以上靶点可能为YKG治疗UC的有效靶点(如图3)。

图2 愈溃凉血颗粒(YKG)-溃疡性结肠炎(UC)的靶点映射

图3 愈溃凉血颗粒(YKG)-溃疡性结肠炎(UC)的靶点蛋白质与蛋白质相互作用(PPI)网络拓扑图

2.3 GO富集分析

GO富集分析发现，90个靶点主要涉及260个GO条目，进一步以P<0.01为筛选标准，共获得199个GO条目，其中BP 包括144个，CC包括24个，MF包括31个，根据P值分别取前10的条目进行可视化处理(见图4)，其中BP以蓝色条形表示，有细胞增殖、细胞凋亡、基因表达的调控、信号传导、氧化还原、老化、低氧应答等；CC以绿色条形表示，有胞外区、质膜、胞浆、细胞表面等；MF方面以橙色条形表示，有蛋白结合、蛋白质同二聚体活性、酶结合、类固醇激素受体活性等。

2.4 KEGG通路富集分析

在DAVID 6.8对YKG和UC的90个靶点进行分析，大约得到105条KEGG通路，以P<0.01为筛选标准共获得79条KEGG通路，其中主要涉及细胞增殖、氧化应激、激素调节等，选择关联性最高的20条绘制气泡图，图中通路富集的靶点数量越多气泡越大，P值越小气泡颜色越红(见图5)。同时结合UC的疾病特点可知，YKG对UC的治疗作用主要与磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidyl inositol 3 kinase, PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B, Akt)信号通路、TNF信号通路、低氧诱导因子-1(hypoxia-inducible factor-1, HIF-1)信号通路有关。

图5 愈溃凉血颗粒(YKG)-溃疡性结肠炎(UC)的靶点的KEGG通路富集分析

3 讨论

YKG是参照中医治疗“下利”经典名方组成思路并结合药物现代药理学分析组方而成，方中白头翁为君药，味苦而能清热，性寒而能凉血，入大肠经而能止痢疾，《药性论》中谓其可止腹痛及赤毒痢，现代用之于UC之黏液脓血便甚效。方中黄连、黄柏、黄芩、秦皮同为苦寒之药走气分，合而用之在清热的基础上燥湿浊厚肠道。由于UC的活动期见大量血便，故予之地榆、白及，二者皆为收敛之品，可敛疮又可敛泄痢而生肌；乌梅丸是治疗厥阴病主方，其基本病机为“上热下寒、寒热错杂”，方中重用乌梅厥阴之阴，兼以酸敛止痢，乌梅丸原方热性药物太多，考虑UC主要病理因素为湿热之毒所主，所以化裁后用炮姜取其味苦而性辛温阳，可温中止泻，又可止血痢；肉桂能引无根之火以归元，通一身之上下，性热而能散寒止痛，《普济方》中谓其可治下痢赤白而腹痛不能食；黄芪升提下利之气，而防止大剂量清热之品耗伤中气；白芍为缓急而止痛的要药，用之以缓解腹痛且能敛阴养血和营，白芍、甘草与黄芩配伍，取止痢名方黄芩汤之意专治血痢。

网络药理学研究表明，YKG中含有丁子香萜、槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇等化合物187个。YKG防治UC的预测靶点有TP53、JUN、PTGS2、TNF、MMP2、EGFR、IL-2等90个，其中TP53的阳性表达与肿瘤的发生发展有关[13，14]。UC是结直肠癌(colorectal cancer, CRC)的高危因素。多项研究对UC结肠黏膜组织进行免疫组化分析发现，P53蛋白呈阳性表达[15，16]。一项大样本的研究结果表明，患有CRC的UC患者中P53蛋白表达显著高于有不典型增生UC患者，P53的表达与UC-CRC的癌变以及不典型增生的UC的发展密切相关。JUN是具有多种细胞因子和趋化因子的多能转录因子，对UC的炎症状态的调控具有重要作用[17]。由于UC的长期上皮溃疡可导致CRC的发生，故UC患者可表现出P53与JUN的水平变化。PTGS2与溃疡形成、炎性状态密切相关，PTGS2的表达是由细胞因子和生长因子诱导的，在UC的炎症过程中被上调，且PTGS2激活会产生前列腺素E2，其作用于许多细胞信号传导途径，包括细胞增殖、血管生成、凋亡、侵袭和免疫抑制等[18-20]。TNF是一种机体内极重要的多效性细胞因子，其中TNF-α是TNF家族的多向性的促炎性细胞因子，与本研究的预测靶点IL-6、IL-1β在UC中均存在高表达[22-24]。MMP2在细胞外基质降解和蛋白水解酶破坏中起重要作用，能够影响结肠黏膜细胞之间的连接，增加肠黏膜通透性并加重黏膜屏障功能的损害[25-27]，因此有效控制MMP2的表达对于UC的治疗很重要。EGFR对结肠黏膜上皮细胞具有生长、防御、损伤修复的作用[28]，学者研究发现UC结肠黏膜上皮EGFR的表达水平与炎症程度呈负相关，且上皮EGFR表达的降低能够加速溃疡的进展[29]。

GO富集分析显示，YKG治疗UC的作用主要与细胞增殖、细胞凋亡、基因表达的调控、信号传导、氧化还原等生物学过程有关；分子功能方面，与蛋白结合、蛋白质同源二聚活性等方面。

KEGG通路富集分析表明，PI3K-Akt信号通路、TNF信号通路、HIF-1信号通路、NOD样受体信号通路是YKG治疗UC的主要通路，其中PI3K/Akt信号通路是与细胞增殖、炎症发生发展密切相关的通路[30]，UC患者可通过阻断PI3K/Akt信号通路来治疗[31]。YKG治疗UC的90个预测靶点中有13个靶点与TNF信号通路有关，TNF家族中包括30种活性因子，如TNF-α，TNF-α与预测靶点中的IL-2、IL-1β、IL-6都是调节炎症发生进展的重要细胞因子，而UC的迁延不愈与此类细胞因子之间的稳态失衡密切相关[32-34]。HIF-1通路涉及组织缺氧的疾病状态(炎性、缺血性和肿瘤性疾病)[35]，学者通过研究发现，HIF-1通路不仅能对UC的炎症状态引起的缺氧做出反应，而且对缺氧的敏感性还可通过PHD1的炎症依赖性转录来调节，炎症还可促进组织中的保护性HIF-1反应激活[35]。NOD样受体(NOD-like receptor, NLRs)是由适应性和先天免疫细胞共同表达的细胞质受体，称为炎性小体，负责释放成熟的IL-1β和IL-18，NLRs也参与细菌成分的识别和形成肠道菌群，在UC肠道菌群稳态中起保护作用[36，37]。

故本文以网络药理学为研究手段，发现YKG对UC的干预机制涉及多个化合物、作用靶点、通路，研究结果初步阐明了YKG治疗UC的作用机制，与目前国内外的研究结果基本一致，证明网络药理学方法的科学性与可靠性，为进一步临床及实验研究提供了证据。