基于氧化应激-炎症-衰老探讨当归四逆汤对亚急性衰老大鼠免疫功能的影响❋

刘紫微，王振亮，王 兵

(1.河南中医药大学，郑州 450046；2.郑州西亚斯学院，郑州 451100；3.湖北省中西医结合医院，武汉 430000)

氧化应激-炎症-衰老又称氧化性炎症衰老，由De La Fuente提出[1]。免疫-氧化应激-炎症于衰老至关重要，与年龄关联的免疫功能变化以氧化应激和炎症反应为基础，两者在维系机体稳态的免疫反应过程中联系紧密[1，2]。经研究，氧化应激和炎症反应参与许多衰老相关疾病发生发展的病理过程，心血管疾病、糖尿病、神经退行性疾病以及癌症等病因皆与氧化应激引起的免疫应答效应有关[3]，因其导致的免疫细胞衰老最为明显，免疫功能下降是其重要表现之一，摄入抗氧化剂可以改善氧化性炎症衰老的免疫系统功能[1，2,4]。

本实验联合自由基防御系统(anti-oxidative defense systems，ADS)与免疫系统(immune system)，通过研究当归四逆汤对亚急性衰老大鼠学习与记忆能力、脏器指数以及血清中谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、总抗氧化能力(total anti-oxidation capability，T-AOC)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、白细胞介素(interleukin，IL)-2、IL-6以及IL-10的影响，探讨当归四逆汤调节氧化应激-炎症-衰老的免疫系统功能的作用机理，旨在为中医药提高氧化性炎症衰老的免疫系统功能提供实验依据。本研究通过河南中医药大学伦理委员会批准(批号DWLL201805302)。

1 材料

1.1 动物

SPF级6 周龄SD雌性大鼠24只，体质量150～160 g，动物实验许可证号SCXK(鲁)20140007，由济南朋悦实验动物繁育有限公司提供。动物饲养于河南中医药大学SPF级实验室，喂养环境为昼夜循环比(12 h∶12 h)，温度(20±2 ℃)，湿度(50±5)%。

1.2 药物及制备

当归四逆汤方组成：当归12 g，桂枝9 g，白芍9 g，炙甘草6 g，细辛3 g，通草6 g，大枣24 g，质量为69 g/剂，对应的中药免煎颗粒剂量为7.5 g/剂，由华润三九公司生产；维生素E(VE)由大连美仑生物技术有限公司提供。以大鼠与70 kg成人体表面积折算系数为0.018换算，当归四逆汤给药剂量为0.675 g·kg-1·d-1，VE给药剂量为200 mg·kg-1·d-1。

1.3 主要试剂及仪器

D-半乳糖(D-dlactose，D-gal，默克Sigma-Aldrich中国公司，货号G5388)；VE(大连美仑生物技术有限公司，货号MB1951)；IL-2检测试剂盒(货号PI580)、IL-6检测试剂盒(货号PI330)、IL-10检测试剂盒(货号PI528)，上海碧云天生物技术有限公司提供；SOD测定试剂盒(货号A001-1-2)、GSH-Px测定试剂盒(货号A005-1-1)、T-AOC检测试剂盒(货号A015-3-1)、MDA测定试剂盒(货号A003-1-2)，南京建成生物工程研究所提供。

SMA4000型微量分光光度计，北京美林恒通仪器有限公司；Multiskan MK3型全自动酶标洗板机，赛默飞世尔科技(中国)有限公司；BX6200HP型超声波清洗器，上海新苗仪器有限公司；DHG-9076型电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司。

2 方法

2.1 分组、造模与给药

24只雌性SD大鼠随机分为正常组、模型组、当归四逆汤组、VE组4组各6只。模型制备[5-8]通过皮下与腹腔等量联合注射的方式为模型组、当归四逆汤组、VE组大鼠注射D-gal溶液(1000 mg·kg-1·d-1)，正常组大鼠注射等量0.9%氯化钠溶液，每日1次，持续8周。自模型制备起始第2周，当归四逆汤组、VE组大鼠灌胃给药，其余组大鼠给予等量0.9%氯化钠溶液，共给药7周。

2.2 一般状态观察

每日观察并记录大鼠毛发、饮食、排便、精神与行动状态等。

2.3 Morris水迷宫检测

模型制备与治疗结束后进行为期6 d的行为学检测，设置Morris水迷宫进行定位航行试验与空间搜索试验。水迷宫高50 cm、直径130 cm，水池上方设置SuperMaze摄像机，使用SuperMaz软件将水池分成4个象限，择1象限中心处设圆形透明平台，高29 cm、直径10 cm，水平面高约30 cm，水中放入黑色食用色素，水温保持在22 ℃～26 ℃。定位航行试验第1天每只大鼠置于水中适应120 s；第2～5天为训练期，随机选择象限将大鼠放入水中，观察并记录逃避潜伏期；若120 s未寻至平台便引至平台放置10 s，记录潜伏期为120 s。每天早晚训练各2次，训练间期60 s，检测大鼠的学习记忆能力。空间搜索试验第6天移走平台，随机选取1象限将大鼠置于水中，记录其于120 s内经过原平台处的次数，检测大鼠空间位置记忆能力。

2.4 处死与取材

行为学检测后，4%水合氯醛腹腔麻醉大鼠，腹主动脉取血并分离血清；取血后将大鼠转移至超净工作台暴露脏器，剥离脾脏、肝脏、胸腺，将取出的脏器称重。

2.5 脏器指数测定

脏器指数=脏器质量(g)/体质量(g)×100%，运用以上公式计算脾脏、肝脏、胸腺指数。

2.6 比色法、铁离子还原法和酶联免疫吸附试验

比色法检测大鼠血清中SOD、GSH-Px、MDA含量，铁离子还原法检测血清中T-AOC含量，酶联免疫吸附试验检测血清中IL-2、IL-6和IL-10含量，所有步骤均严格按照试剂盒说明书进行。

2.7 统计学方法

3 结果

3.1 各组大鼠一般状态变化

实验期间，正常组大鼠一般状况良好；模型组、VE组、当归四逆汤组大鼠均出现不同程度的饮食降低、毛色无光、褪毛增多、喜静蜷缩且行动迟缓、大便色质改变等，其中模型组大鼠变化最明显，VE组和当归四逆汤组大鼠精神与活动状态较模型组明显改善。

3.2 各组大鼠学习、记忆能力比较

表1示，与正常组比较，模型组大鼠进入逃生平台范围次数明显减少(P<0.01)，逃避潜伏期明显延长(P<0.01)；与模型组比较，VE组和当归四逆汤组大鼠进入逃生平台范围次数明显增多(P<0.05)，逃避潜伏期明显缩短(P<0.05)。

表1 各组大鼠进入逃生平台次数与逃避潜伏期比较

3.3 各组大鼠脏器指数比较

表2示，与正常组比较，模型组大鼠脾、肝、胸腺指数明显下降(P<0.01)；与模型组比较，VE组和当归四逆汤组大鼠脾、肝、胸腺指数明显上升(P<0.05，P<0.01)。

表2 各组大鼠的脾、肝、胸腺指数比较

3.4 各组大鼠血清SOD、GSH-Px、T-AOC、MDA含量比较

表3示，与正常组比较，模型组大鼠血清SOD、GSH-Px、T-AOC含量明显减少(P<0.01)，MDA含量明显升高(P<0.01)；与模型组比较，VE组和当归四逆汤组血清SOD、GSH-Px、T-AOC含量明显升高(P<0.01)，MDA含量明显降低(P<0.01)。

表3 各组大鼠血清SOD、GSH-Px、T-AOC、MDA含量比较

3.5 各组大鼠血清IL-2、IL-6及IL-10含量比较

表4示，与正常组比较，模型组大鼠血清IL-2、IL-10含量明显下降(P<0.01)，IL-6含量明显升高(P<0.01)；与模型组比较，VE组和当归四逆汤组大鼠血清IL-2、IL-10含量明显升高(P<0.01)，IL-6含量明显降低(P<0.01)；与VE组比较，当归四逆汤组大鼠血清中IL-2、IL-10含量明显升高(P<0.01)，IL-6含量明显降低(P<0.01)。

表4 各组大鼠血清中IL-2、IL-6和IL-10含量比较

4 讨论

现代医学认为，疾病发生发展是营养代谢与免疫炎症的矛盾斗争，中医调控代谢和免疫平衡的论述多集中于营卫学说[9]。当归四逆汤为调和营卫之祖方桂枝汤化裁而成，方中当归养血活血，白芍更增其滋阴养血之功；与通草相配以通利血脉；与桂枝、细辛配伍温煦血脉，除陈寒积冷以助血脉通畅。桂枝、白芍调和营卫；大枣、炙甘草健脾养血，与酸甘之白芍更益滋阴和营之功；全方养血和营、温阳通脉，擅治气血不和、营卫阴阳失调诸证[10]。

学习记忆能力减弱是衰老的标志性行为学表现之一[11]，脏器因衰老导致形态结构和生物化学变化是其生理功能衰退的基础，因此脏器指数是探讨衰老的途径之一[12]。加快衰老的诱因与其致使的表现常互为因果。氧化应激是自由基在体内堆积而引起的氧化损伤，自由基代谢异常是造成衰老的主要原因之一[13]。衰老可致清除自由基功能减弱，外源性物质攻击可致自由基代谢异常，诱发脂质过氧化致使氧化应激损伤；在免疫激活和效应阶段，消灭外来或改变自身抗原的同时机体出现炎症反应，免疫细胞对氧化应激更为敏感[14]，氧化应激使免疫细胞、免疫器官受损，致使免疫功能下降又加速衰老[13,15]；衰老导致代谢产物堆积是引起炎症的重要原因之一[16，17]，氧自由基亦是炎症反应的效应器[18，19]。因此，免疫、氧化应激、衰老三者以自由基为中介，炎症反应为表象，形成互相影响、互为因果的疾病发生发展闭环。

超氧化物自由基、过氧化氢(hydrogen peroxide，H2O2)、羟基自由基(hydroxyl radical，-OH)、过氧化脂质(lipid peroxide，LPO)与氧化应激紧密相关，超氧化物是含有超氧离子(superoxide，O2-)的化合物，氧分子通过呼吸作用转为O2-，O2-可以衍生H2O2、-OH；-OH经脂质过氧化产生氢过氧化物(hydroperoxide，ROOH)；LPO是不饱和脂肪酸与氧自由基作用所形成的过氧化物[20]。SOD是酶促防御系统的第一道防线，SOD可以加速O2-歧化反应，在消除活性氧的毒性过程中发挥重要作用，并参与免疫反应[21，22]，衰老程度与T淋巴细胞的寿命皆与SOD的含量有关[23]；GSH-Px主要清除ROOH，并能广泛迅速地清除H2O2，降低自由基产生的氧化损伤[24]。SOD、GSH-Px是酶促防御系统的重要标志物[25]，SOD与O2-反应生成H2O2, 再由GSH-Px催化H2O2生成水, 清除自由基对细胞的毒害作用, 保护细胞免受损伤。T-AOC可以分解和清除活性氧自由基，是反映综合抗氧化功能的指标[26]，SOD、GSH-Px和VE的抗氧化能力皆可用T-AOC体现[27]。MDA是LPO最终分解产物之一，LPO过量直接损伤大脑发育致大脑早衰甚或痴呆，并且增强血小板凝集性，是导致粥样动脉硬化和血管老化的重要因素，同时抑制免疫功能，其含量与脏器衰竭数目呈正相关。同时MDA破坏线粒体结构与功能造成肝脏损伤[28]，因此MDA含量可以反映氧自由基水平、过氧化反应的程度以及脏器功能[13,29，30]。IL-6是较为常见的促炎因子，具备调控细胞的生长与生化、调节免疫的功能，参加炎症反应[31]。IL-2为增强免疫系统功能的良性细胞因子[32]，可提高抗体含量[33]，促进T、B细胞特异性分化[34]，是获得性免疫的关键环节[35]，在维持调节T细胞内稳层面具有至关重要的意义[36]。IL-10可以加强适应性免疫，抵制炎症与T细胞凋亡[37]，可以抑制所有促炎细胞因子生成[38]，IL-10还能通过抑制核转录因子-κB活性起到抑制肝纤维化的作用[39]。

本研究表明，中医学“营卫”与氧化性炎症衰老的免疫系统功能密切相关。当归四逆汤通过增加衰老机体血清中SOD、GSH-Px、T-AOC的含量，提升自由基防御系统功能，清除O2-、H2O2等自由基，减少体内ROOH和LPO等过氧化物的含量，减少MDA缓解氧化应激损伤，增强学习记忆能力，减轻脏器萎缩的退行性改变，降低免疫细胞的损伤，增加血清中IL-2、IL-10含量，降低IL-6含量，提高免疫系统功能，避免炎症反应。当归四逆汤抗氧化能力与VE处于同一水平，提升衰老机体免疫力的效果优于VE，其机制仍需进一步探讨。