基于网络药理学探讨青蒿琥酯治疗获得性免疫缺陷综合征的作用机制❋

马 冲，张洪岐，刘 颖

(1.中国中医科学院中医基础理论研究所，北京 100700；2.中国中医科学院中医药防治艾滋病中心，北京 100700)

获得性免疫缺陷综合征(acquired immune deficiency syndrome，AIDS)是人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)侵犯人体免疫系统，发生各种机会性感染和肿瘤的综合征。截至2020年10月底，我国报告现存HIV/AIDS患者104.5万例，当年新增HIV感染者11.2万例[1]。抗逆转录病毒治疗(antiretroviral therapy，ART)能够有效控制HIV复制，延长患者寿命，但HIV对T细胞的直接作用导致的异常免疫激活可造成疾病进展[2]。此外，免费药物种类稀少、治疗依从性不佳及药物不良反应等问题，也对AIDS的治疗造成一定的影响[3]。目前，中西医结合治疗正越来越多地应用于AIDS患者的治疗中，具有较好的疗效和治疗优势[4]。

青蒿琥酯(Artesunate)是青蒿素衍生物，具有抗疟、抗肿瘤、抗病毒及诱导细胞凋亡等作用[5]，是经济、高效、低毒的抗疟用药。此外，青蒿琥酯也是有效的免疫抑制剂，对多种免疫性疾病具有较好的治疗作用。对感染猴免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency virus，SIV)的中国恒河猴模型的研究显示，青蒿琥酯可调控CD4+T细胞极化，抑制辅助T细胞17(helper T cell 17，Th17)的细胞增殖，促进调节性T细胞(regulator T cell，Treg)增殖[6]，促进Th17/Treg平衡[7]，改善T细胞免疫异常激活[2]。本课题组在国家“十三五”科技重大专项临床研究中发现，青蒿琥酯能够改善AIDS患者CD4细胞计数水平，促进患者免疫功能重建。由此可见，青蒿琥酯对于AIDS患者免疫功能具有一定的调节作用，但具体机制尚不清晰。为此，本研究采用网络药理学方法，从医学、生物学、计算机科学、生物信息学等多学科交融的研究角度，探索青蒿琥酯治疗AIDS的分子机制。

1 方法

1.1 青蒿琥酯靶点获取

本研究的药物名称为青蒿琥酯片，通过药物说明书及相关文献可知其化学成分为青蒿琥酯，故仅针对青蒿琥酯的分子结构进行靶点筛选。应用PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)检索其分子结构，并获得其2 D结构图，将2 D结构图上传至Pharmmapper数据库(http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)[8-10]，与Swiss Target Prediction数据库(http://www.swisstargetprediction.ch/)[11]，以获得化合物的蛋白质靶点，并在Uniprot数据库(https://www.uniprot.org/)将蛋白质靶点进行规范化处理。

1.2 AIDS靶点获取

以“acquired immune deficiency syndrome”为关键词在GeneCards(https://www.genecards.org/)[12]、OMIM(https://omim.org/)[13]、TTD(http://db.idrblab.net/ttd/)[14]、DRUGBANK数据库(https://go.drugbank.com/)[15]进行潜在靶点挖掘。在GeneCards数据库检索疾病靶点时，Score值越高表明靶点与疾病关系越密切，因此若靶点过多，则根据经验选取大于Score中位数的潜在靶点，之后将4个数据库的靶点进行合并，删除重复值后获得AIDS靶点。

1.3 青蒿琥酯-AIDS靶点PPI网络构建与分析

为明确青蒿琥酯与AIDS之间的相互作用，应用VENNY2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)绘制韦恩图，并获取二者交集靶点。将交集靶点上传至STRING11.0数据库(https://www.string-db.org/)[16]，以此构建蛋白互作(protein-protein interaction，PPI)网络模型，物种设置为“Homo sapiens”，最小互作阈值设定为“medium confidence(>0.4)”，余设置均为默认设置。获取结果后保存为TSV文件，导入至Cytoscape3.8.2，利用MCODE插件进行模块化分析，对其特征进行分析，筛选核心模块。

1.4 青蒿琥酯-AIDS靶点功能与通路的富集分析

DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp)聚集了各种公共基因组资源，集成度高且注释数据覆盖全面[17，18]。将青蒿琥酯-AIDS交集靶点提交至DAVID数据平台，进行GO富集分析(生物过程、细胞组成、分子功能)及KEGG富集分析，探索其潜在作用的生物学过程及代谢通路，并对结果进行可视化分析。

2 结果

2.1 青蒿琥酯结构及靶点

初步获取青蒿琥酯靶点373个，合并剔除重复值后共获取靶点333个(见图1)。青蒿琥酯2D结构图(见图2)。

2.2 AIDS相关靶点

由GeneCards数据库获得AIDS相关靶点7761个，根据Score值中位数限定靶点选取范围，如中位数为23.34则设定Score>23.34的靶点为AIDS潜在靶点。结合OMIM、DRUGBANK、TTD数据库合并相关靶点，剔除重复值后共获得1040个AIDS相关靶点。

2.3 青蒿琥酯-AIDS靶点PPI网络构建及核心靶点筛选结果

筛选青蒿琥酯靶点与AIDS靶点后选取二者交集靶点，并绘制韦恩图，得到青蒿琥酯-AIDS交集靶点85个(见图3)。进而将交集靶点上传至STRING11.0平台获得青蒿琥酯-AIDS靶点PPI网络，共85个节点562条连接(见图4)。利用Cytoscape中MCODE插件进行模块化分析，筛选出4个核心模块(A、B、C、D)，其聚类评分依次为13.75、5.83、4、4，此结果表明核心模块中靶点对其他节点具有较大影响力(见图5)。

图3 青蒿琥酯-AIDS靶点韦恩图

图4 青蒿琥酯-AIDS靶点PPI网络

图5 青蒿琥酯-AIDS核心靶点模块

2.4 青蒿琥酯-AIDS的GO富集分析与KEGG富集分析

应用DAVID数据库对青蒿琥酯治疗AIDS的相关靶点进行富集分析，借助网络绘图平台对数据进行可视化分析。GO富集分析显示，该类靶点涉及的生物过程主要包括肽基络氨酸磷酸化、信号传导、DNA复制、细胞增殖、血管生成、细胞迁移、血小板活化、凝血等方面(见图6A)；细胞组成主要包括胞质溶胶、质膜、膜筏、核质、内质网、线粒体、细胞质、核染色质等(见图6B)；分子功能主要包括蛋白质结合、受体活性、受体结合、酶结合、类固醇结合、酶活性、转录因子结合等(见图6C)。KEGG富集分析显示，青蒿琥酯治疗AIDS涉及的通路主要包括缺氧诱导因子-1(hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)信号通路、叉头盒转录因子O(forkhead box transcription tactor O，FoxO)信号通路、磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3/kinase-protein kinase B，PI3K/Akt)信号通路、大鼠肉瘤病毒(rat sarcoma virus，Ras)信号通路、Ras相关蛋白1(ras related protein 1，Rap1)信号通路、趋化因子信号通路等(见图6D)，靶点通路结果(见表1)。

表1 青蒿琥酯治疗AIDS相关靶点通路富集结果

注：A：GO-BP分析；B：GO-CC分析；C：G0-MF分析；D：KEGG分析

3 讨论

我国AIDS的防控与治疗已取得了长足的进步，目前HIV/AIDS处于低流行趋势[1]。ART的出现使得AIDS逐渐成为一种慢性、可控性疾病，AIDS患者生存期逐渐延长，生活质量明显提高，但是我国AIDS治疗也面临着较多的困难，长期治疗使得患者老年化伴随的合并症、ART药品种类少、抗病毒药物花费大及耐药等问题日益突出[19]。中医药在改善AIDS患者症状、免疫功能及不良反应等方面不断进行探索，并取得了一定的成果[20，21]。因此，从中医药领域探索AIDS的补充与替代治疗，开发中医药治疗的新药和新方法，或许能够成为AIDS研究的重要方向。

网络药理学基于疾病-基因-靶点-药物作用网络，通过分析平台、中药数据库、靶标预测技术等，系统揭示药物与人体相互作用的机制[22]，在中药机制研究、新药发现、药物重新定位及不良反应等方面具有较大的应用价值[23，24]。本研究共收集333个药物靶点及1040个疾病靶点，映射后获得85个潜在作用靶点562条相互作用关系。通过核心模块筛选获得雌雌激素受体1(estrogen receptor 1，ESR1)、丝裂原活化蛋白激酶1(mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1)、核受体亚家族3C组成员1(nuclear receptor subfamily 3 group C member 1，NR3C1)、胱天蛋白酶3(Caspase 3，CASP3)、磷脂酰肌醇激酶-3催化亚单位α(phosphatidylinositol 3-kinase catalytic alpha polypeptide，PIK3CA)、表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)、信号传导和转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)等核心基因。研究显示，ESR1可直接抑制HIV转录[25]，NR3C1、CASP3能够限制HIV的复制[26，27]，EGFR、AKT-1、STAT3等对HIV-1具有潜在的激活作用[28]。由此可见，青蒿琥酯可能通过调控以上靶点的作用治疗AIDS。

本研究通过富集分析显示，青蒿琥酯治疗AIDS主要涉及HIF-1、FoxO、PI3K/Akt、Ras、Rap1及趋化因子信号通路等。PI3K/Akt信号通路在细胞周期、HIV潜伏、调节线粒体及Treg细胞等方面具有重要作用[29，30]。HIV-1包膜蛋白(env)与宿主细胞表面CD4的相互作用首先激活PI3K/Akt信号通路，随后HIV-1包膜糖蛋白(gp120)与宿主细胞表面的辅助受体(CCR5/CXCR)相互作用，使得跨膜糖蛋白(gp41)发生构象变化，从而诱导膜融合，使介导病毒进入宿主细胞内[31]。在T细胞中，抗原受体(T cell receptor，TCR)与CD28可导致PI3K激活，导致质膜磷脂酰肌醇4,5-二磷酸(PIP2)中肌醇环的3-羟基磷酸化生成磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸(PIP3)，PIP3充当Akt及其上游激活剂PDK1质膜对接位点，促使Akt激活，mTOR的磷酸化可促进Akt最大限度激活，从而调节T细胞功能，之后p-Akt通过抑制FoxO1活性而抑制记忆CD8T细胞的形成和T细胞多个阶段的功能[32]。此外，PI3K/Akt信号通路在调节Treg细胞及线粒体功能方面具有负反馈作用，抑制PI3K/Akt信号通路，可恢复Treg细胞及线粒体功能[33-35]。本研究显示，诸如FoxO、HIF-1、Ras等信号通路也在青蒿琥酯治疗HIV/AIDS中发挥重要作用。FoxO家族能够通过控制B淋巴细胞与T淋巴细胞的发育及功能，维持免疫稳态，FoxO失活可导致慢性炎症及自身免疫[36]，介导FoxO信号通路相关蛋白被上调后，可促进HIV-1介导的巨噬细胞在生产性感染期间凋亡[37]，促进免疫功能恢复。Ras信号通路能够调节细胞生长、分化、运动等过程[38]，HIV-1 Tat通过激活Ras信号通路促进AIDS相关性痴呆的发生发展[39]。同时研究表明，通过Ras信号通路基因表达的差异可对ART中断后的CD4+T细胞下降程度进行预测[40]。HIF-1信号通路受在HIV-1感染的外周血单个核细胞中的几种下调miRNA调控，HIF信号通路中的HIF-1α可与缺氧反映元件(hypoxia-responsive element，HRE)结合，导致诸多凋亡通路相关基因上调，从而促使CD4+T细胞凋亡[41]，使AIDS患者免疫功能进一步下降，推进疾病进展。

综上所述，本研究通过网络药理学初步探索了青蒿琥酯治疗AIDS的靶点及其相互作用网络，预测青蒿琥酯可通过不同生物学过程及信号通路发挥作用，体现了多通路、多靶点以及相互作用的特点，为进一步开展青蒿琥酯治疗AIDS的临床及动物研究提供了科学依据，也为青蒿琥酯在AIDS治疗中的临床应用奠定了基础。由于网络药理学方法的局限性以及青蒿琥酯治疗AIDS的研究正处于发展阶段，使得本研究存在一定的不足，仍需进一步深入探索。