不同浓度七氟醚对大鼠海马去甲肾上腺素、5-羟色胺水平 及P2X3表达的影响

陈 勇 庞红利 宋俊杰 张 晗 毛珊珊 彭 莉 王 莹

（河南大学，1 第一附属医院，开封 475001；2 医学院，开封 475004）

七氟醚是临床广泛应用的无色透明吸入麻醉药剂。吸入七氟醚，患者在120 s左右意识模糊[1]，即可进行手术，临床上广泛应用于儿童，使用较为广泛[2]，但随着在使用过程中及对术后患者症状深入研究显示，七氟醚会降低患者体内去甲肾上腺素（norepinephrine，NE）、5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）水平及对嘌呤能受体（purinergic receptor）P2X3表达产生抑制作用[3-4]。七氟醚可抑制NE再提取，5-HT可能作为吸入式麻醉药物影响认知功能的靶点，被证实吸入式麻醉药物会消耗5-HT，降低大鼠认知学习能力[5]。 P2X3为痛觉的相关受体，已有研究表明，外周P2X3受体在初级感觉神经元介导的痛觉中发挥重要作用，能够参与不同类型病理性疼痛的发生和维持，通过吸入式麻药进行麻醉，在手术中使痛觉受体P2X3的表达明显降低，从而减轻患者因手术等造成的痛感[6-7]。但七氟醚作为一种吸入式麻醉药剂，对P2X3受体的影响机制尚不明确，因此，本研究通过大鼠实验，观察不同浓度的七氟醚对大鼠NE、5-HT水平及P2X3表达的影响。

1 材料和方法

1.1 实验动物

120只健康雄性大鼠购自河南省动物实验中心，鼠龄8周左右，体质量290~300 g，室温为24℃左右，自由采食和摄水，在无压环境下让大鼠适应1周新环境。实验动物编号：SYXK（沪）2017-0015。

1.2 试剂与仪器

本次实验所用到的试剂和仪器分别是：七氟醚（孟成科技有限公司）、P2X3一抗、羊抗兔二抗和Cy3荧光二抗（均购自北京方程嘉鸿科技）；Datex-Ohmeda监护仪。

1.3 动物分组与模型建立

挥发罐内加入七氟醚，连接好小动物麻醉机管路和Datex-Ohmeda监护仪及麻醉气体检测套件，将麻醉诱导箱关闭后预充入七氟醚和氧气，放入大鼠。对照组吸入1∶1氧气与空气的混合气体2 h，七氟醚低、中及高剂量组分别吸入1%、2%及3%的七氟烷与氧气混合气体2 h[8]。待麻醉完成后关闭麻醉罐连接七氟醚气体吸附器，待大鼠自然苏醒，活动自如后回笼。

1.4 大鼠麻醉后行为测定

逃逸平台随机放置任意象限（3象限除外），放入水中的大鼠若60 s内爬上平台，停留20 s，若找不到，则引导其至平台，停留20 s，形成即时空间记忆。间隔30 s后重复上述操作，记录潜伏期。麻醉前一天撤去平台，将大鼠沿槽壁放入水中，记录120 s内目标象限持续时间、目标象限路程、穿越平台次数，计算原平台所在象限时间占总时间比、原平台所在象限路程占总路程比。

1.5 高效液相检测NE、5-HT含量

大鼠断头处死，在冰上迅速剥离出右侧海马，称重，加入0.4 mL预冷的工作内标液，快速匀浆，静置10 min，4℃条件下10 000 r/min离心15 min，取上清液，过滤，-80℃保存，检测NE、5-HT的含量。

1.6 免疫荧光组织化学检测P2X3

4组大鼠麻醉，取鼠脑海马CA1区组织，4%多聚甲醛固定24 h，脱水、石蜡包埋切片，片厚约10 μm。脱蜡、水化、热抗原修复和灭活内源性过氧化物酶后，BSA封闭后加入P2X3一抗（1∶500），4℃过夜，滴加Cy3荧光二抗（1∶500），避光孵育1 h，显微镜下观察结果，显现红色荧光为P2X3受体阳性。

1.7 免疫印迹检测

4组大鼠麻醉，取脑海马组织，裂解组织，BCA法测定蛋白浓度，SDS-PAGE电泳，转膜，封闭1 h，TBST冲洗，加入P2X3单克隆抗体（1∶ 1 000），4℃孵育过夜，羊抗兔二抗（1∶3 000）室温孵育1 h，采用ECL曝光拍照，软件分析条带灰度值，每组重复检测3次。

1.8 海马区神经元形态观察

麻醉结束后12 h，取出脑组织，于冰上迅速分离一侧大脑海马，液氮速冻后-80℃保存，经脱水、透明、浸蜡、包埋后，沿视交叉后4 mm行连续冠状切片，切片行H-E染色后观察海马CA1区锥体细胞形态及数量。

1.9 TUNEL检测海马组织神经元细胞凋亡

将厚度为2 µm的海马组织石蜡切片脱蜡至水，经PBS清洗，2%H2O2室温孵育10 min，抑制内源性过氧化物酶，PBS冲洗，15 µg/mL蛋白酶K消化15 min，37℃，PBS冲洗，浸入37℃ TUNEL 混合液1 h（200 µL中含1 µL TDT 20 µ/mL和l µL FITC-dUTP混合液），PBS冲洗，0.05%H2O2显色 5 min，并采用流水冲洗终止反应，苏木精染 1 min，水洗后盐酸乙醇分化30 s，水洗蓝化以常规树脂封片，光镜下观察凋亡细胞呈棕黄色，每张切片在200倍镜下随机选择10个视野进行观察。

1.1 0 统计学处理

采用SPSS 23.0软件分析，计量资料用±s表示，4组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 麻醉后大鼠行为变化

对照组大鼠在苏醒1 d逃避潜伏期（46.23± 5.31）s明显低于中、低七氟醚组（P＜0.05），并且随着七氟醚浓度的升高，苏醒后2~5 d逃避潜伏期逐渐增长（P＜0.05），中、低七氟醚组随着苏醒时间的增长逃避期下降，高七氟醚组在苏醒后1~2 d逃避潜伏期时间相似，均在第3天出现下降，且各时间点逃避潜伏期明显长于中、低七氟醚组（P＜0.05）（表1）。

表1 各组大鼠麻醉后逃避潜伏期的变化（±s，s）

表1 各组大鼠麻醉后逃避潜伏期的变化（±s，s）

*P＜0.05 vs对照组；#P＜0.05 vs低七氟醚组；△P＜0.05 vs中七氟醚组

组别 苏醒后1 d 苏醒后2 d 苏醒后3 d 苏醒后4 d 苏醒后5 d对照组 46.23±5.31 25.23±2.67 16.41±3.61 9.82±1.12 6.22±0.78低七氟醚组 48.71±5.34 30.23±1.44* 20.42±3.14* 15.55±2.91* 11.78±1.67*中七氟醚组 51.78±6.43* 35.61±3.24*# 25.43±2.28*# 19.67±2.15*# 14.45±1.78*#高七氟醚组 53.56±6.21* 50.41±5.86*#△ 45.45±5.01*#△ 42.24±4.72*# 39.34±4.21*#

2.2 空间探索实验结果

与对照组相比，低、中、高七氟醚组麻醉后1 d穿越原平台次数、总路程差距较小（P＞0.05），7 d穿越原平台次数、总路程、目标象限路程差距较小（P＞0.05），低、中、高七氟醚组各时间点目标象限持续时间缩短，原平台所在象限时间占总时间比、原平台所在象限路程占总路程比下降（P＜0.05），高七氟醚组麻醉后1 d目标象限路程缩短（P＜0.05）。与低七氟醚组相比，中七氟醚组的各指标均无差异（P＞0.05）。与低、中七氟醚组相比，高七氟醚组麻醉后1 d目标象限持续时间缩短，原平台所在象限时间占总时间比、原平台所在象限路程占总路程比下降（P＜0.05）（表2）。

表2 各组空间探索实验结果对比（±s）

表2 各组空间探索实验结果对比（±s）

*P＜0.05 vs对照组；#P＜0.05 vs低七氟醚组；△P＜0.05 vs中七氟醚组

组别 苏醒后时间目标象限持续时间（s）目标象限路程（cm） 总路程（cm） 穿越平台次数（次）原平台所在象限时间占总时间比原平台所在象限路程占总路程比对照组 1 d 35.22±6.31 410.14±45.63 1526.33±125.44 2.45±0.36 0.29±0.06 0.29±0.06*7 d 36.13±6.14 442.26±62.31 1564.21±178.62 3.22±0.74 0.31±0.06 0.31±0.06*低七氟醚组 1 d 27.62±3.11* 361.42±33.41 1633.42±147.26 2.61±0.32 0.24±0.03* 0.24±0.03*7 d 26.35±4.12 358.25±31.62 1699.24±152.33 1.33±0.24 0.23±0.05* 0.23±0.05*中七氟醚组 1 d 27.54±3.05* 352.64±30.11 1602.14±152.34 1.12±0.13 0.24±0.02* 0.24±0.02*7 d 27.67±4.22* 336.14±35.27 1592.37±149.26 1.34±0.24 0.24±0.07* 0.24±0.07*高七氟醚组 1 d 20.42±2.13*# 282.31±26.37* 1781.33±182.46 2.24±0.31 0.17±0.03*#△ 0.17±0.03*#△7 d 27.82±3.11* 385.47±40.12 1822.33±192.36 2.84±0.29 0.23±0.04* 0.23±0.04*

2.3 海马NE、5-HT含量变化

与对照组大鼠海马NE、5-HT水平比较，吸入七氟醚3组NE水平及5-HT水平明显降低（P＜0.05），且随着七氟醚浓度升高，NE、5-HT水平也逐渐降低；高七氟醚剂量组大鼠NE水平及5-HT水平明显低于中、低七氟醚组（P＜0.05） （表3）。

2.4 免疫荧光组织化学检测海马P2X3表达变化

各组大鼠脑海马组织内神经元均有P2X3蛋白阳性表达，且表达程度不相同，其阳性表达主要位于细胞质内，在细胞膜处有高表达，在细胞核内无表达，主要位于中、小神经元。对照组因未进行麻醉处理，阳性表达最高，低七氟醚组有较高表达，随着七氟醚浓度的升高，P2X3阳性表达逐渐降低（图1，见封二）。

图1 各组大鼠脑组织内P2X3表达，×200。 A：对照组；B：低七氟醚组；C：中七氟醚组；D：高七氟醚组。A1～D1：DAPI染色；A2～D2：FITC染色；A3～D3：合并.图3 各组大鼠神经元形态，H-E染色，×200。 A：对照组；B：低七氟醚组；C：中七氟醚组；D：高七氟醚组.图4 各组大鼠海马组织神经细胞凋亡率比较，TUNEL染色，×200。 A：对照组；B：低七氟醚组；C：中七氟醚组；D：高七氟醚组.

表3 各组大鼠海马区NE、5-HT含量（±s，ng/g）

表3 各组大鼠海马区NE、5-HT含量（±s，ng/g）

*P＜0.05 vs对照组；#P＜0.05 vs低七氟醚组；△P＜0.05 vs中七氟醚组

组别 NE 5-HT对照组 351.09±32.79 403.59±32.01低七氟醚组 328.34±30.69* 346.45±30.91*中七氟醚组 300.01±27.96*# 308.21±31.63*#高七氟醚组 281.63±25.98*#△ 283.04±28.34*#△

2.5 免疫印迹检测海马P2X3表达变化

P2X3/β-actin比值各组间比较差异有统计学意义（P＜0.05），对照组P2X3蛋白表达（0.90±0.04）显著高于七氟醚高、中、低组（P＜0.05），与低七氟醚组P2X3蛋白表达（0.80±0.05）比较，中七氟醚组（0.61±0.06）及高七氟醚组（0.39±0.01）P2X3蛋白表达逐渐降低（P＜0.05）（图2）。

图2 各组大鼠P2X3蛋白表达

2.6 海马区神经元形态观察

H-E染色切片观察海马区锥体神经元，对照组和七氟醚低剂量组细胞较为完整、呈现有序致密，神经细胞大小较均匀。七氟醚中、高剂量组海马区神经元排列紊乱，细胞核固缩显著，但七氟醚高剂量组更显著（图3，见封二）。

2.7 海马组织神经细胞凋亡率比较

结果显示，对照组、七氟醚低、中、高组大鼠神经元细胞凋亡率分别为12.55%±1.69%，18.42%±2.21%，24.10%±2.66%，36.22%± 3.62%，差异有统计学意义（P＜0.05）；与对照组相比，七氟醚低、中、高组大鼠神经元细胞凋亡率均增加，差异有统计学意义（P＜0.05）（图4，见封二）。

3 讨论

七氟醚是现阶段比较常用的吸入式麻醉药，具有诱导速度快、药效学和药代动力学特性优越、对患者呼吸道安全不会引发呼吸系统疾病、吸入七氟醚的患者苏醒较迅速和医生能够较好控制患者麻醉的深浅等优点[9-10]，较广泛应用于临床麻醉，尤其在儿童手术中，七氟醚占麻醉药剂的主导地位，成为临床上较为常用的一种吸入式麻醉药。但随着广泛使用及术后患者不良反应及症状的深入研究，显示七氟醚麻醉后一般会产生短暂的认知障碍，以70岁以上的老年手术人群为主[11-12]，部分患者认知障碍持续时间较长，且不可逆。相关研究表明七氟醚对记忆的形成和诱导神经退行性变化产生一定的影响。近年来研究显示七氟醚麻醉术后的不良影响表现[13]，影响神经及其递质传递，如NE、5-HT等，抑制时效增长。一定浓度的七氟醚导致神经元细胞凋亡情况明显，且七氟醚的浓度越高，凋亡情况越明显，可改变β淀粉样蛋白表达[14]，介导七氟醚对细胞的毒性作用。Tau蛋白过度磷酸化与记忆损害有关，是诱导阿尔茨海默症发病的主要原因之一，表现为认知功能障碍。七氟醚麻醉可产生短暂可逆的Tau蛋白磷酸化，重复持续的麻醉可使Tau磷酸化更持久，也可导致血清白介素6、肿瘤坏死因子α浓度增加。神经递质和神经通路是近年研究的热点[15]，不同浓度七氟醚对大鼠NE、5-HT水平及P2X3通路的影响是本研究主要内容。

单胺类神经递质是一种在中枢神经系统内进行信息传递产生交流的主要物质，并且能够调节哺乳动物的神经系统，使其产生兴奋或抑制[16]。NE、5-HT均属于单胺类神经递质。脑内NE主要与体表温度、人体的运动功能表达、痛觉表达和激素水平调节有关。5-HT作为单胺类神经递质，具有一定传递信息的作用，在大脑皮质及神经突触内含量很高[17]，对信息传递过程起抑制作用，并通过分布在各处的5-HT受体起作用，对生理活动具有一定的调节作用，如认知、情感等。有研究表明，5-HT含量受七氟醚毒性影响较大，七氟醚能够消耗5-HT，减少海马组织NE[18]。本研究结果表明，NE与5-HT水平随着七氟醚的浓度的增加而降低。在尹彩星等[19]、 尹楠等[20]运用不同浓度的七氟醚进行研究显示，5-HT、NE水平随着七氟醚浓度的增加而降低，影响大鼠的认知功能。本研究结果与上述研究结果相似，且本研究水迷宫实验及空间探索实验结果也表明七氟醚影响大鼠的认知及行为能力。

P2X3受体属于嘌呤能受体，包括腺苷作用的P1受体和P2受体，介导痛觉过敏的形成；根据受体在药理学及其生物化学方面的主要表现，将P2受体分为两大类：P2X受体和P2Y受体，目前已经成为治疗疼痛的主要突破口。P2X3主要分布于一些中、小神经元，直径较大的神经元上分布较少。P2X3在大鼠脑部也同样存在。在背根神经节中，P2X3分布于小假单极神经元，用于疼痛信息的传递[21]。敲除P2X3受体基因的大鼠，显示该大鼠对疼痛的阈值显著下降，证实与该受体缺陷有关，表明P2X3在伤害性信息传递产生中起着一定作用。因此大鼠在通过七氟醚麻醉后痛觉降低，P2X3表达也随之降低[22]。本研究结果显示，与对照组相比，随着七氟醚浓度的增加，P2X3水平逐渐降低。王玉洁等[23]运用舒芬太尼对神经病理性疼痛大鼠进行研究显示，舒芬太尼可降低P2X3水平，减少大鼠神经性病理疼痛。在邢娟等[24]对偏头痛大鼠进行研究表明，5-HT与P2X3表达呈正相关关系。本研究结果与上述研究结果相似，因此本研究认为七氟醚可能会通过降低5-HT水平，进而降低P2X3表达，促使大鼠认知及行为能力降低，且本研究H-E染色结果也证实七氟醚损伤了海马CA1区锥体神经元，海马区作为存储记忆及维持大脑正常功能的区域，其受到损伤后会进一步抑制大鼠学习能力。

本研究存在一定不足之处，除了对NE、5-HT以及P2X3受体进行检测外，未对其他递质或受体进行研究，实验方案设计中缺乏较长时间观察组，故对麻醉后出现的认知障碍是否可逆存疑，今后应增加研究样本量，充实实验内容为相关研究提供依据。

综上所述，七氟醚作为一种吸入式麻醉药剂，随着其浓度的增加，会降低NE、5-HT水平及抑制P2X3表达，降低大鼠记忆能力。