添加乳酸菌和纤维素酶对菠萝渣青贮发酵品质和体外发酵的评价

吴征敏 彭 苏,2* 王志敬,3 杨 康,2 邱晓媛吴鹏鑫 许悦雯 王嘉麟 尹福泉**

(1.广东海洋大学滨海农业学院，湛江524088；2.广东省农业科学院动物科学研究所，畜禽育种国家重点实验室，农业农村部华南动物营养与饲料重点实验室，广东省畜禽育种与营养研究重点实验室，广东畜禽肉品质量安全控制与评定工程技术研究中心，广州510640；3.广东省清远市动物疫病预防控制中心，清远511518)

菠萝(Ananascomosus)果肉营养丰富，是全球第三大热带水果，我国是菠萝十大主产国之一，菠萝消费量大[1]。菠萝渣是菠萝在生产加工过程中产生的副产物，主要为菠萝皮和菠萝花冠等，约占果实的1/2以上，其营养成分与菠萝果肉相差无几[2]。大量菠萝渣被加工厂直接作为废弃物丢弃，这不仅是对资源的极大浪费，而且也会对环境造成很大的污染[3]。菠萝渣含有黄酮、维生素、糖类、蛋白质和多种矿物元素等，具有较高的营养和经济价值[2-3]，是潜在的饲料资源。在天然草场退化、人畜争粮问题突出的当下，将菠萝渣转化为耐储存的高饲用价值的生物饲料，不仅可以缓解气候对饲草粮供给的制约，还可降低饲养成本。新鲜菠萝渣营养物质流失少，但不进行处理容易因腐烂而损失较多的营养物质[2]，青贮发酵可长期有效保存青饲料的营养物质，使用青贮添加剂可有效缩短青贮时长，提高青贮成功率和青贮发酵品质[4]，进而缓解饲粮短缺压力，降低饲料成本。许多学者发现，青贮中添加乳酸菌能够迅速增加乳酸菌数量，使其成为优势菌群，抑制有害微生物的繁殖，改善青贮发酵品质[5]。纤维素酶可分解植物中的纤维素、半纤维素，提高植物纤维的利用率，还可为乳酸菌的快速繁殖提供底物，是一种绿色青贮添加剂，且在反刍动物生产应用中取得了较好的生产和经济效益[6]。已有研究显示，用菠萝渣饲喂贵妃鸡[7]、育肥猪[8]和肉牛[9]，可提高其生长性能和生产性能，降低饲养成本。目前，有关乳酸菌和纤维素酶对菠萝渣青贮品质的影响鲜有报道，需进一步研究。因此，本试验以菠萝渣为研究对象，评价乳酸菌和纤维素酶对菠萝渣青贮发酵品质及对体外模拟瘤胃发酵特性的影响，以期确定适宜的青贮发酵添加剂，为合理青贮和利用菠萝渣提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与动物

试验动物为健康、体重[(25.75±0.78) kg]接近的3只成年雷州山羊，将其作为瘤胃液供体羊。主要试验材料包括：菠萝渣(主要为菠萝的花冠和果皮)来自广东省湛江市某食品加工公司，纤维素酶(酶活力≥10000U/g)来自南宁某生物科技有限公司，乳酸菌(活菌数≥100亿/g)来自台湾某生物科技有限公司。

1.2 青贮饲料调制

试验设对照组(CON组，不添加青贮剂)，在此基础上，设置纤维素酶组(CE组，添加0.150 g/kg纤维素酶)、乳酸菌组(LAB组，添加0.025 g/kg乳酸菌)、复合菌酶组(CE+LAB组，添加0.150 g/kg纤维素酶和0.025 g/kg乳酸菌)，共设置4个组，每组有3个重复。将菠萝渣取回后斩碎，将其放到通风处晾晒至含水量为65%～70%备用。菠萝渣青贮前营养成分见表1。把晾晒好的菠萝渣与各添加剂混合均匀，分别按每袋4 kg的量将其装入青贮袋中，抽真空密封，做好标记放入青贮桶内再密封，室温青贮60 d。

1.3 样品采集

青贮60 d后开封，取样分析。取20 g青贮饲料样品放到锥形瓶中，加入180 mL蒸馏水，搅拌均匀，4 ℃条件下浸提24 h，在此期间不间断地摇动锥形瓶，24 h后收集过滤后的浸提液。用S220-K型酸度计测定pH，剩余滤液置于-20 ℃保存备用，用于测定氨态氮(NH3-N)、乳酸(LA)、乙酸(AA)、丙酸(PA)和丁酸(BA)的浓度。将剩余的青贮饲料样品分2部分，一部分样品放到-20 ℃冰箱中保存备用;另一部分用105 ℃的烘箱烘2 h后，将温度调到65 ℃烘至恒重，取出样品，粉碎机粉碎后冷冻保存，用于测定其他指标。

表1 菠萝渣青贮前营养水平(风干基础)

1.4 样品分析

1.4.1 营养成分分析

参照AOAC(1995)[10]常规方法测定烘干粉碎样的干物质(DM)、粗灰分(Ash)、粗蛋白质(CP)的含量，采用范式(Van Soest)洗涤纤维测定法[11]测定样品中粗纤维(CF)、酸性洗涤纤维(ADF)和中性洗涤纤维(NDF)的含量。参考国际标准ISO 27085—2009(高锰酸钾法)测定钙(Ca)含量。参考国际标准GOST R 50852—1996(磷钒钼酸比色法)测定磷(P)含量。

1.4.2 发酵品质分析

取适量的青贮饲料样品滤液并稀释至200倍，用0.22 μm滤膜过滤后，取25 μL样品滤液用高效液相色谱仪ICS-3000(戴安，美国)测定样品中乳酸、乙酸、丙酸和丁酸的浓度，多种有机酸经AS11分析柱(250 mm×4 mm)及AG11保护柱分离，流动相洗脱条件为：氢氧化钾梯度，0～5 min，0.8～1.5 mmol/L；5～10 min，1.5～2.5 mmol/L；10～15 min，2.5 mmol/L，流速为1 mL/min。采用蒽酮比色法[12]测定可溶性多糖(WSC)含量，采用盐酸萘乙二胺法(GB 13085—1991)[13]测定亚硝酸盐含量，采用氧化镁蒸馏法[14]测定NH3-N浓度。

1.5 瘤胃体外发酵

晨饲前从3头装有瘤胃瘘管的雷州山羊瘤胃中收集新鲜的瘤胃液，并迅速带回实验室。将其置于(39.0±0.5) ℃恒温水浴锅中，用纱布过滤，滤液持续通入二氧化碳(CO2)。根据Menke等[15]方法配制人工唾液，并将人工唾液与瘤胃液按照体积比9∶1的比例混合均匀[16]，制备发酵液。取70 mL发酵液加入到装有1.25 g左右风干粉碎回潮后的菠萝渣青贮饲料样品中，放入充满CO2且体积为200 mL的产气瓶内封存，封闭后放于(39.0±0.5) ℃的恒温振荡培养箱内。对照组、纤维素酶组、乳酸菌组和复合菌酶组连续培养48 h，并在6、12、24和48 h时记录产气数值，每个时间点设置5个重复和2个空白对照。空白对照组只添加70 mL发酵液，发酵原料营养水平见表1。

培养结束后，将各时间点产气瓶取出，用针筒测得各时间点的产气量(GP)，测完产气量后立即用pH测定仪测定发酵液pH，并放入4 ℃冰箱终止微生物活动。静置后用移液枪吸取2 mL发酵液，加入0.4 mL 8.2%的偏磷酸溶液放于-20 ℃冰箱保存，用于测定各时间点挥发性脂肪酸(VFA)的浓度(采用Agilent 6890气相色谱仪测定[17])。剩余滤渣用尼龙布过滤，滤液置于-20 ℃冰箱保存，用于测定各时间点NH3-N的浓度(测定方法与上述相同)。用纯水将培养瓶中的滤渣全部冲洗出来，并将滤渣从尼龙布取出用纯水冲洗干净，置于65 ℃烘箱内烘至恒重后称重。烘干样粉碎，于-20 ℃冰箱保存，用于测定其他指标，测定方法与上述测定法相同。

1.6 菠萝渣青贮饲料相对饲用价值(RFV)和养分降解率计算

青贮后菠萝渣RFV计算公式[18]如下：

RFV=DMI×DDM/1.29；DMI=120/NDF; DDM=88.9-0.779/ADF。

式中：DMI为青贮饲料DM的随意采食量(% BW)；DDM为可消化干物质含量(% DM)；1.29为盛花期紫花苜蓿的DMI×DDM。

养分降解率计算公式如下：

某养分降解率(%)=[(试验原料中该养分质量-
发酵后滤渣中该养分质量)/试验原料中
该养分的质量]×100。

1.7 数据处理及统计分析

试验数据用Excel 2019软件进行整理，采用SPSS 26.0软件中的ANOVA模型进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，采用Duncan氏法进行多重比较，其中P<0.05表示差异显著，结果以“平均值和均值标准误(SEM)”表示。

2 结 果

2.1 2种青贮添加剂对菠萝渣青贮饲料营养成分的影响

由表2可知，与CON组相比，CE组和LAB组的DM含量均显著降低(P<0.05)，LAB组和CE+LAB组的CP含量显著增加(P<0.05)，CE组的P含量显著高于其余各组(P<0.05)。添加剂对菠萝渣的Ash、NDF、ADF和Ca含量无显著影响(P>0.05)。

2.2 2种青贮添加剂对菠萝渣青贮饲料发酵指标的影响

由表3可知，与CON组相比,CE+LAB组的pH显著升高(P<0.05)，其余组无显著差异(P>0.05)。添加剂组NH3-N/TN均显著降低(P<0.05)。CE组和CE+LAB组WSC的含量显著升高，LAB组WSC的含量显著降低(P<0.05)。LAB组的亚硝酸盐含量最低，显著低于对照组(P<0.05)。各组的RFV均高于100。

2.3 2种青贮添加剂对菠萝渣青贮饲料有机酸浓度的影响

由表4可知，各组均未检测到丁酸，且添加剂组对青贮菠萝渣乳酸、乙酸和丙酸浓度无显著影响(P>0.05)。CE+LAB组的乳酸与总酸比值最低，显著低于其他各组(P<0.05)。

表2 2种青贮添加剂对菠萝渣青贮饲料营养成分的影响(风干基础)

表3 2种青贮添加剂对菠萝渣青贮饲料发酵指标的影响

表4 2种青贮添加剂对菠萝渣青贮饲料有机酸浓度的影响

2.4 2种青贮添加剂对菠萝渣青贮饲料体外瘤胃pH和NH3-N浓度的影响

由表5可知，青贮发酵6和12 h时，各组间pH无显著差异(P>0.05)。与CON组相比，发酵24 h时CE组pH显著降低(P<0.05)，发酵48 h时LAB组pH显著降低(P<0.05)。

由表6可知，6～48 h体外瘤胃发酵的NH3-N浓度均不显著(P>0.05)。从整体来看，随着发酵时间的增加，各组的NH3-N浓度均呈现出先减少后增加的变化趋势，变化的范围在7.72～18.14 mg/dL。

2.5 2种青贮添加剂对菠萝渣青贮饲料体外瘤胃VFA浓度的影响

由表7可知，发酵6 h时，与CON组相比，添加剂组的乙酸浓度有降低的趋势(P=0.09)，丁酸浓度显著降低(P<0.05)。发酵24 h时，LAB组丙酸浓度显著低于对照组(P<0.05)。发酵12和48 h时，各组间体外瘤胃VFA浓度无显著差异(P>0.05)。

表5 2种青贮添加剂对菠萝渣青贮饲料体外瘤胃pH的影响

表6 2种青贮添加剂对菠萝渣青贮饲料体外瘤胃NH3-N浓度的影响

表7 2种青贮添加剂对菠萝渣青贮饲料体外瘤胃VFA浓度的影响

由表8可知，发酵6～48 h时，各组的体外瘤胃总挥发性脂肪酸(TVFA)浓度均无显著差异(P>0.05)，各组的体外瘤胃TVFA浓度随着发酵时间的延长也在逐渐升高。

2.6 2种青贮添加剂对菠萝渣青贮饲料体外瘤胃产气量的影响

由表9可知，发酵12 h时，CE+LAB组的产气量显著高于其他各组(P<0.05)，发酵48 h时，CE+LAB组的产气量显著低于其他各组(P<0.05)。发酵6～48 h时，各组的体外瘤胃产气量逐渐增加，发酵24～48 h时，产气量增加幅度变小，说明发酵趋于稳定。

表8 2种青贮添加剂对菠萝渣青贮饲料体外瘤胃TVFA浓度的影响

表9 2种青贮添加剂对菠萝渣青贮饲料体外瘤胃产气量的影响

2.7 2种青贮添加剂对菠萝渣青贮饲料体外瘤胃养分降解率的影响

由表10可知，发酵6 h时，CE组的体外瘤胃干物质降解率(DMD)显著高于CON组(P<0.05)。其余时间段，各组间均无显著差异(P>0.05)。各组的体外瘤胃DMD随发酵时间的延长而增加，发酵24～48 h时，体外瘤胃DMD增加幅度变小，说明发酵趋于稳定。

表10 2种青贮添加剂对菠萝渣青贮饲料体外瘤胃干物质降解率的影响

由表11可知，随着发酵时间的推移，各组的体外瘤胃中性洗涤纤维降解率(NDFD)也在增加，发酵24～48 h时，体外瘤胃NDFD增加幅度变小。各时间点的体外瘤胃NDFD均无显著差异(P>0.05)。

表11 2种青贮添加剂对菠萝渣青贮饲料体外瘤胃中性洗涤纤维降解率的影响

由表12可知，发酵6和12 h时，CE组和LAB组的体外瘤胃粗蛋白质降解率(CPD)显著高于CON组(P<0.05)，CE+LAB组与CON组无显著差异(P>0.05)。发酵24 h时，各组间体外瘤胃CPD均无显著差异(P>0.05)。发酵48 h时，各添加剂组的体外瘤胃CPD显著高于CON组(P<0.05)。整体来看，随着发酵时间的推移，各组的体外瘤胃CPD也在增加。

表12 2种青贮添加剂对菠萝渣青贮饲料体外瘤胃粗蛋白质降解率的影响

3 讨 论

3.1 添加纤维素酶和乳酸菌对菠萝渣青贮饲料营养成分及发酵品质的影响

植物饲料的青贮品质是由多个指标综合决定的[19-21]。青贮pH高低是检验发酵料优劣的直观指标[22]，NH3-N/TN则反映青贮饲料中蛋白质的转化情况[23]。其中，不良微生物会促进丁酸产生，并分解蛋白质产生NH3-N[19]，提高NH3-N/TN，降低青贮饲料品质[23]。本研究pH(4.26～4.37)小于4.5且各组均未检测到丁酸，说明梭菌等腐败菌的生长受到了抑制[22,24]，青贮良好。各组菠萝渣青贮饲料中均未检出丁酸，原因可能有3个方面：一方面菠萝渣青贮原料呈酸性[25]，且含有一定量的乳酸菌和蛋白酶等[26-27]，减少了其他杂菌对发酵底物的污染；另一方面，菠萝渣本身含有抑菌作用的活性成分，如黄酮类等，有助于制作青贮饲料[28-29]；另外，添加剂可促使青贮发酵更早进入稳定期，有效抑制不良微生物的活性，提高青贮品质[30]。此外，发酵底物、处理方式、添加剂的种类和接种量等差异均会影响pH的变化[31]。申成利等[32]发现，将菠萝皮与不同种类乳酸菌混合添加均可显著降低柱花草青贮发酵pH(小于4.2)，改善柱花草青贮品质。吕仁龙等[33]报道，不同比例的菠萝皮与木薯茎叶混贮，pH均显著降低(添加20%、40%和50%菠萝皮的青贮pH小于4.2)，青贮品质有效提升。本试验pH未降到4.2以下可能是青贮原料缺乏某些营养物质导致，因此，可进一步探究菠萝渣适宜的混贮调制工艺。

添加剂组的NH3-N/TN显著低于对照组，且均小于10%[23]，说明使用添加剂可减少蛋白质和氨基酸的分解，提高青贮品质。此外，与对照组相比，乳酸菌组和复合菌酶组CP含量分别提高26.85%和22.72%，亚硝酸盐含量分别降低22.88%和17.80%，而纤维素酶活性无显著差异。CP可反映饲料的饲用价值，其含量越高代表营养价值越好[31]。亚硝酸盐是由青贮发酵不良或保存不当产生，其含量小于10 mg/kg的青贮饲料对家畜是安全的[34-35]。菠萝渣青贮饲料的亚硝酸盐含量在0.91～1.19 mg/kg，用作动物饲料是安全的。使用乳酸菌发酵的CP含量最高，亚硝酸盐含量降低量最大，说明添加0.025 g/kg乳酸菌可更好地抑制青贮菠萝渣中不良微生物的活性，减少蛋白质损失，防止亚硝酸盐产生，青贮效果更好，这与赵超等[36]的研究结果相似。可溶性还原糖是青贮中重要的营养物质，在豆渣和桑叶混贮中添加乳酸菌降低了WSC的含量[36]。本研究乳酸菌组的菠萝渣WSC含量显著降低，可能是在青贮前期，乳酸菌的快速繁殖消耗了大量的WSC，而添加的纤维素酶和复合菌酶能分解菠萝渣中的部分结构性多糖，转化为可溶性碳水化合物，提高WSC含量[6]。

3.2 添加纤维素酶和乳酸菌对菠萝渣青贮体外瘤胃发酵特性的影响

瘤胃内环境pH影响瘤胃微生物的正常生理活动，其正常范围在5.0～7.5[37]。本试验整个体外发酵期pH均在正常瘤胃微生物发酵范围之内，表明本试验使用的添加剂对瘤胃微生物的生长繁殖无负面影响。NH3-N浓度的高低可体现瘤胃内微生物的生物活性[38]，本研究显示，NH3-N浓度(7.72～18.14 mg/dL)均在正常范围内(6～30 mg/dL)[39]，且满足菌体蛋白合成的需要量(0.35～29.00 mg/dL)[40]，菠萝渣青贮饲料对瘤胃微生物的生物活性有益。

VFA以乙酸、丙酸和丁酸为主，可为反刍动物提供70%～80%的能量[41]，其含量及组成成分反映瘤胃微生物的活力及碳水化合物的可消化程度[42]。本试验显示，菠萝渣青贮饲料瘤胃体外发酵相同的发酵时间点乙酸浓度均最高，产气量与VFA浓度有正相关关系，这与邹诗雨等[42]的研究结果一致。研究显示，反刍动物采食后，瘤胃在一定时间内快速发酵从而迅速产生大量VFA，经瘤胃微生物及瘤胃壁的吸收利用后，VFA浓度降低[43]。本试验由于采用体外瘤胃进行发酵，产生的VFA不能通过瘤胃壁被吸收且无法通过其他方式排出，因此被累积在发酵装置中，致使VFA浓度呈线性增加。以上结果显示，添加纤维素酶和乳酸菌的青贮菠萝渣对体外瘤胃发酵无负面影响，可满足瘤胃内正常发酵的营养需求。

3.3 添加纤维素酶和乳酸菌对菠萝渣青贮饲料体外瘤胃产气量和养分降解率的影响

产气量可综合反映瘤胃微生物对青贮原料的消化利用程度[44-45]。本试验发酵12和48 h时，复合菌酶组的产气量分别显著高于和低于其他各组，说明使用复合菌酶对菠萝渣前期体外发酵具有促进作用。而使用单一添加剂的产气量与对照组均无显著差异，这可能与菠萝渣细胞壁结构、添加剂降解该纤维能力和发酵速度的差异有关。研究发现，不同类型发酵底物的体外发酵产气量是有差异的，纤维素含量高的小麦秸秆发酵速度较慢，发酵72 h其营养成分还未被完全消化利用[46-47]。此外，增加结构性碳水化合物的比例会减慢饲料在瘤胃内的降解速度，推后产气高峰[48]。本试验添加剂对菠萝渣的产气量无明显改善作用，可能是该添加剂单独使用对高纤维菠萝渣的结构性碳水化合物降解能力较差，及48 h的发酵时间对于菠萝渣而言，未能充分利用其中的养分，这还有待后续试验进一步验证。消化率是影响动物采食的重要因素，其在很大程度上受该青贮饲料的化学成分尤其是植物细胞壁含量的影响[20]。DMD可反映瘤胃微生物对青贮饲料的利用程度。本试验的DMD、NDFD没有呈现显著变化，可能是由于不同品种羊之间的差异所导致的。Ranilla等[49]发现2个品种的羊中，Churra羊对不同干草的DMD和NDFD明显高于Merino羊，且植物细胞壁的成分含量越高，品种间的这种降解差异越大。此外，NDF的组成比例也会影响其降解率，一般木质素含量越高，NDFD会越低[50]。本试验的DMD和NDFD未能显著提高，可能是菠萝渣饲料(由菠萝皮和菠萝花冠组成)本身细胞壁的成分含量大且木质素含量高，而青贮添加剂对该纤维的降解能力不强所致。除化学组成的因素外，微生物对菠萝渣的吸附能力也可能是造成这种结果的原因之一[46]。青贮料经瘤胃微生物消化利用，产生菌体蛋白，可为反刍动物提供所需蛋白质的40%～80%[51]。微生物对瘤胃中停留时间较长的青贮饲料消化作用更佳，CPD更高[52]。本研究显示，发酵48 h时,各添加剂组的CPD均显著高于对照组，且随着体外瘤胃发酵时间的延长，菠萝渣青贮饲料的CPD也在提高，说明本试验选用的纤维素酶和乳酸菌均可有效提高菠萝渣青贮饲料的易发酵程度，从而提高瘤胃微生物对CP的降解率。

4 结 论

本试验结果表明，使用青贮添加剂可以改善菠萝渣的青贮发酵品质和营养价值。体外瘤胃发酵试验显示，用青贮菠萝渣饲喂雷州山羊是安全可行的。在本试验条件下，添加0.025 g/kg的乳酸菌对改善菠萝渣青贮品质的效果相对较好，维持瘤胃正常发酵，有助于饲料养分的消化吸收。