瑞香狼毒化感物质释放的时间和空间变化规律研究

＊基辉 程济南 程锦春 杨晓燕 关基凤 秦波*

（1.中国科学院兰州化学物理研究所中国科学院西北特色植物资源化学重点实验室/甘肃省天然药物重点实验室 甘肃 730000 2.烟台中科先进材料与绿色化工产业技术研究院 山东 264006 3.兰州大学草地农业科技学院 甘肃 730000 4.西北民族大学化工学院 甘肃 730000 5.内蒙古通辽市市场检验检测中心 内蒙古 028000）

植物根系、根际微生物和根际土壤的相互作用，构成了植物根际微生态系统。外来植物入侵会引起土壤生态系统发生改变，形成有利于入侵植物生长的土壤生态系统，进而形成单优势植物群落并快速扩张蔓延[1]。在这一过程中，化感作用发挥着不可替代的作用。化感作用是一种生物体相互干扰的生态现象，主要用于控制杂草、抗病虫害以及改善土壤营养与微生物的相互作用[2]。入侵植物在入侵过程中产生一系列化感物质，从而发挥较强的化感作用，成为植物和土壤之间相互作用的调节者[3]。近些年，许多入侵成功的植物在入侵过程中都伴随着强烈的化感作用，化感作用成为入侵植物加速扩张、抑制本土植物生长的有力武器[4]。入侵植物的化感作用，在学者探究外来植物入侵机制中得到越来越多的关注。

瑞香狼毒为瑞香科狼毒属多年生草本植物，在中国广泛分布于甘肃、新疆、宁夏等地区，是我国西北高寒草地的主要有毒杂草之一，近年来，瑞香狼毒由于强大的生态适应性和高度的竞争性，目前已成为中国草地退化的标志性植物之一[5]。现今对于瑞香狼毒的研究，多集中在形态学、化学活性、生物防治等方面，而瑞香狼毒的化感作用研究报道较少。在前期研究中，共分离鉴定出瑞香狼毒的7种化感物质，并明确了瑞香狼毒化感物质随地理分布的变化规律。然而对于瑞香狼毒化感物质的报道，更多的是集中在单个化感物质的提取及活性测定等方面[6]。迄今为止，未见有对不同生长时期、不同盖度下，瑞香狼毒根际土壤和根中化感物质种类、含量及变化规律的研究报道。本文采用高效液相色谱测定瑞香狼毒根际土壤及根中化感物质，探究化感物质种类和含量的时空变化规律。本研究对于控制瑞香狼毒种群蔓延，治理瑞香狼毒引起的草地退化问题具有重要意义，也为瑞香狼毒的生物防控提供理论基础。

1.材料与方法

(1)材料和样地

实验样地位于祁连山东麓天然草原，甘肃省天祝藏族自治县抓喜秀龙乡炭窑沟村（37°7′36″N，102°50′3″E），属于亚高山和高山属寒冷湿润气候。选择5月中旬—6月中旬瑞香狼毒展叶期（Leaf emergence，LE），6月中下旬—8月初盛花期（Full bloom，FB），8月中旬—9月中下旬果实成熟期（Seed maturation，SM），10月初—第二年5月中旬休眠期（Dormancy period，DP），共4个生长时期进行样品采集。依据瑞香狼毒生长盖度分别为0%、25.1%、52.6%以及89.7%选择样地，每个样地重复四次，样地信息见表1。不同样地之间间隔50m以上。每个样地挖取6株健康瑞香狼毒植株，先轻轻抖落根围土块，再用无菌毛刷收集粘附在根表的土壤，即为瑞香狼毒根际土壤，每个重复的根际土壤和根样品分别混合成一个样品，带回实验室4℃下保存备用。

表1 样地信息表

(2)标准曲线的制作

瑞香狼毒7种化感物质伞形花内脂、狼毒色原酮、西瑞香素、异新狼毒素A、新狼毒素B、二氢瑞香素B、7-甲氧基新狼毒素的标准品购买于武汉天植生物技术有限公司（www.chemfaces.com）。将单个化感物质标准品溶于色谱甲醇，配置成2μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、25μg/mL、50μg/mL以及100μg/mL的6个质量浓度梯度标准液，再配置7种化感物质混合液一份。通过对洗脱程序、检测波长、流速的筛选，最终确定瑞香狼毒化感物质高效液相色谱条件如下：色谱柱：250mm×4.6mm、5μm粒径的Symmetry C18反相柱；检测波长为300nm；流动相流速：1mL/min；流动相：A相为乙腈，B相为含0.2%乙酸的水；进样量：20μL；洗脱梯度：0～6min：20%～30% A；6～8min：30%～35% A；8～15min：35～45% A；15～18min：45～60% A；18～20min：60～80% A；20～25min：80% A。将6个梯度的标准液通过高效液相色谱仪进行峰面积测定，每个质量浓度重复3次。以各质量浓度峰面积平均值为纵坐标，浓度为横坐标制作标准曲线，R2在0.999以上满足要求。建立7种化感物质标准曲线y=ax+b；其中：x为所测样品质量浓度，单位μg/mL；y为高效液相色谱仪器检测出的峰面积（表2）。在上述色谱条件下，伞形花内脂、狼毒色原酮、西瑞香素、异新狼毒素A、新狼毒素B、二氢瑞香素B、7-甲氧基新狼毒素A的出峰保留时间分别为：8.5min、15.6min、16.1min、16.6min、18.6min、19.4min、20.4min。

表2 瑞香狼毒化感物质标准曲线

(3)瑞香狼毒根际土壤和根中化感物质的测定

瑞香狼毒根际土壤于室内阴干后，过40目筛（孔径0.425mm）除去石头、草根等杂质。瑞香狼毒根际土壤样品中按照每100g土样加入300mL的甲醇溶液（m:v=1:3），超声提取30min以上，重复3次；经抽滤除杂后，获得根际土壤粗提溶液A；所述根际粗提溶液A使用旋转蒸发仪除去甲醇后，即得根际土壤粗提物B。瑞香狼毒植株根室内阴干后，通过粉样机粉碎后，称取50g根粉末，加入150mL甲醇溶液（m:v=1:3），超声提取30min以上，重复3次，得到根粗提溶液E；所述根粗提溶液E通过使用旋转蒸发仪除去甲醇后，即得根粗提物F。

分别称取根际土壤粗提物B和根粗提物F，加入色谱级甲醇溶液，配制成2mg/mL的溶液，并通过0.22μm的有机滤膜除去杂质，得到待测溶液C和待测溶液D。采用高效液相色谱（HPLC）分别对待测溶液C和D进行检测，通过外标法确定瑞香狼毒化感物质保留时间。通过比对化感物质标准曲线峰面，进行换算即得瑞香狼毒根际土壤和根中化感物质含量。瑞香狼毒根际土壤和根粗提物中，单个化感物质质量M=V•A（y-b）/（a•A1），A1=V•w，式中：V为每次进样的体积，单位μL；A为粗提物总质量，单位g；A1为每次进样的消耗样品质量，单位mg；w为进样浓度，单位mg/mL。

(4)数据处理

瑞香狼毒化感物质数据处理使用Excel 2016软件进行，通过SPSS 26.0进行方差检验，使用Origin 2018对数据进行可视化处理。

2.结果与分析

(1)瑞香狼毒根际土壤化感物质随生长季节与盖度的变化

瑞香狼毒根际土壤样品中共检测出5种化感物质，分别为狼毒色原酮、异新狼毒素A、新狼毒素B、二氢瑞香素B以及7-甲氧基新狼毒素A。如图1所示，每千克根际土壤中，展叶期以及盛花期瑞香狼毒化感物质含量显著高于结实期以及休眠期。瑞香狼毒展叶期89.7%种群盖度下，根际土壤中每种化感物质含量最高；休眠期25.1%种群盖度下瑞香狼毒根际土壤化感物质含量最低。根际土壤中5种化感物质含量在展叶期、结实期以及休眠期随着瑞香狼毒种群盖度增加而增加；在瑞香狼毒盛花期根际土壤中化感物质含量各异，表现为52.6%种群盖度下各化感物质含量最高，而新狼毒素B则随着种群盖度增加而降低。如图2所示，瑞香狼毒根际土壤化感物质含量随着生长季节的变化，呈现下降的趋势，展叶期根际土壤中化感物质含量最高，休眠期化感物质含量最低。

图1 瑞香狼毒根际土壤化感物质含量变化规律

图2 不同种群盖度瑞香狼毒根际土壤化感物质含量随生长阶段的变化趋势

(2)瑞香狼毒根中化感物质随生长季节与盖度的变化

瑞香狼毒不同生长季节、不同种群盖度根部样品中共检测出7种化感物质（图3）。50g瑞香狼毒根中所得化感物质含量显著高于每千克根际土壤中的化感物质含量。展叶期以及盛花期瑞香狼毒根中化感物质含量显著高于果实成熟期以及休眠期。根中新狼毒素B含量最高，伞形花内脂含量最低。盛花期根中伞形花内脂含量明显高于其他生长季节，总体上根中伞形花内脂含量远远低于其余6种化感物质。根中狼毒色原酮含量在展叶期以及盛花期随着种群盖度增加而增加。展叶期西瑞香素含量明显高于其它生长阶段，呈现随种群盖度增加而降低的趋势；其余生长时期西瑞香素含量则表现为随种群盖度增加而增加的趋势。各生长季节的52.6%种群盖度下的异新狼毒素A在含量差异较大，而展叶期和盛花期的新狼毒素B含量远高于其它阶段及其它种群盖度。瑞香狼毒根中二氢瑞香素B在各生长阶段及52.6%种群盖度下含量最高，但在休眠期随种群盖度增加而呈下降趋势。7-甲氧基新狼毒素A在展叶期以及盛花期瑞香狼毒根中含量较为接近，但在展叶期52.6%种群盖度的土壤样品中含量最低。瑞香狼毒根中化感物质含量随着生长季节的变化，呈现下降的趋势，展叶期根中化感物质含量最高，休眠期根中化感物质含量最低，但伞形花内脂则是在盛花期阶段根中含量最高（图4）。

图3 瑞香狼毒根中化感物质含量变化规律

图4 不同种群盖度瑞香狼毒根中化感物质含量随生长阶段的变化趋势

3.讨论

瑞香狼毒作为西北天然草地主要的入侵毒草之一，其根含有剧毒，严重影响着我国西北草地的生产力以及畜牧业[7]。化感物质是瑞香狼毒入侵竞争的重要手段之一，前期研究证明，瑞香狼毒化感物质会抑制瑞香狼毒周围牧草的生长[8]。在瑞香狼毒根际土壤中检测出5种化感物质。在瑞香狼毒根的粗提物中，7种化感物质均检测出来。瑞香狼毒化感物质含量在展叶期以及盛花期中多于结实期以及休眠期。狼毒色原酮、异新狼毒素A、新狼毒素B、二氢瑞香素B、7-甲氧基新狼毒素A在根际土壤及根中含量较高，根际土壤中5种化感物质含量在展叶期、结实期以及休眠期随着瑞香狼毒生长盖度增加而增加，而在根中化感物质含量则表现各异，可能是因为瑞香狼毒植株对其化感物质的影响较大。此外，对比瑞香狼毒根中化感物质含量，发现伞形花内脂以及西瑞香素含量较低，而瑞香狼毒释放到土壤中含量也较少，这可能是其在根际土壤中无法检测出的原因。西瑞香素在展叶期中随着生长盖度的增加含量呈下降趋势，其后三个生长时期大致呈现随盖度增加而含量增加的趋势，Chen等[9]研究发现褪黑素只在植株幼苗阶段促进生根的作用，因此西瑞香素可能是在瑞香狼毒入侵的最初阶段发挥作用。随着生长时期的变化，根际土壤以及根中化感物质含量呈现一个逐渐下降的趋势，展叶期根中化感物质含量高于其余3个生长时期，这与该时期瑞香狼毒生长活性及根系合成和释放能力强有关[10]。植物根系释放有机物质的含量，受到植物内部及外部条件的影响，如营养状况、根际pH、土壤微生物等的影响[11]，这可能是盛花期根际土壤中和根中各个时期化感物质含量趋势存在差异性的原因。

4.结论

在瑞香狼毒根际土壤中检测出狼毒色原酮、异新狼毒素A、新狼毒素B、二氢瑞香素B、7-甲氧基新狼毒素A 5种化感物质，在瑞香狼毒根的粗提物中7种化感物质均检测出来。瑞香狼毒根际土壤和根中化感物质含量随生长季节变化呈现下降趋势，化感物质含量在展叶期以及盛花期中多于结实期以及休眠期。通过对瑞香狼毒根际土壤和根中化感物质随生长季节和种群盖度的变化规律研究，对于控制瑞香狼毒在天然草地的种群蔓延，治理瑞香狼毒引起的草地退化问题具有重要意义。