新型冠状病毒检测技术的应用研究进展

黄象娟，黄象艳

1 山东医学高等专科学校济南校区医学检验系，济南 250002；2 解放军联勤保障部队第九六〇医院输血医学科

新型冠状病毒肺炎（COVID-19）的持续大流行不仅引发了全球卫生紧急情况，而且对经济、公共卫生等方面带来了挑战。在这场危机中，我国和世界各地的科学家以及研究人员不断努力，以各种可能的方式遏制这种疾病，包括疫苗接种、治疗和诊断。为了控制COVID-19 的传播，准确有效的早期诊断至关重要［1］。临床诊断COVID-19 时，除了依据流行病学史、临床表现和计算机断层扫描（CT）结果外，最重要的是通过新型冠状病毒（SARS-CoV-2）实验室检测结果进行确诊，包括核酸检测和血清学检测［2］。无症状携带者的不断增加，进一步说明了只有对人群中病毒携带者进行正确检测才能对抗病毒的快速传播，快速准确的病毒检测对于控制和预防COVID-19 具有重要作用。SARS-CoV-2 的检测方法主要分为分子生物学方法和免疫学方法两大类。分子生物学方法是基于SARS-CoV-2 RNA 的检测方法，在正确的时间从准确的部位收集标本对于分子生物学方法检测至关重要。免疫学方法可以检测呼吸道分泌物中的病毒抗原，也可以检测血液中的抗体。便携式病原体快速检测具有操作简单、检测速度快的特点，也在迅速发展［3］。各种SARS-CoV-2 检测方法可根据需求应用于不同的场景［4］，包括无症状人群筛查、有针对性的高危人群筛查、接触者调查、临床诊断、疾病严重程度监测、传染性监测和回顾性全人群筛查。本研究对SARS-CoV-2 检测技术的应用情况进行综述，为不同检测目的和需求下选择合适的检测技术和标本类型提供参考，从而有效管理COVID-19病例并限制病毒进一步传播。

1 分子生物学方法的应用

SARS-CoV-2 的基因组结构包含大约30 kb 的RNA，核酸检测是确认SARS-CoV-2感染的标准实验室诊断。随着SARS-CoV-2基因组序列的发布，形成了包含引物、探针和热循环条件的标准化实验室检测推荐方案［5］。核酸扩增试验（NAAT）是最灵敏的试验，通常是检测早期病毒感染的首选试验。目前已开发不同类型的NAAT 方法用于SARS-CoV-2 检测，包括逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术、环介导等温扩增检测（LAMP）技术、成簇的规律间隔短回文重复序列（CRISPR）技术和基因测序技术［6］，同时需要注意，NAAT需要高质量的病毒RNA［2］。

1.1 RT-PCR 技术的应用 进行鼻咽标本SARSCoV-2 RNA 检测的RT-PCR 技术广泛用于病毒检测实验室［3］，从全球角度来看，这是最流行的金标准技术［4，7］。即使是低水平的病毒，这种检测也能通过扩增在早期发现疾病，所以它是最常用和最可靠的检测方法，在病毒感染的初始阶段很有价值。基于RT-PCR 技术的病毒核酸检测，是针对病毒的特定核酸序列进行检测。病毒基因组存在3个保守区域：位于开放阅读框1ab（ORF1ab）中的RNA 依赖RNA 聚合酶（RdRP）基因、核衣壳蛋白（N）基因和包膜蛋白（E）基因［8］。ORF1ab 基因和N 基因常被作为检测靶点［9］；与N 基因相比，RdRP 基因和E 基因检测限更低、灵敏度更高［8］。另外，检测靶位点还包括S 基因和ORF1b 或ORF8 区域［10］。在RT-PCR 反应中检测两个或多个基因，可以增强对真阳性的识别，实验室通常检测2个靶点，检测过多的靶点用以确认结果是费力和费时的。

COVID-19 是一种病毒感染，主要攻击呼吸道。在正确的时间从准确的部位采集标本对于正确的分子生物学检测结果至关重要。标本的选择取决于检测场景、临床特征和疾病阶段。一般认为上呼吸道和下呼吸道标本的病毒检测是诊断活动性临床感染的主要手段，标本采集对核酸检测结果影响很大，支气管肺泡灌洗液、痰液和鼻拭子的检出率最高［11］。对于早期感染或无症状的病例，建议使用上呼吸道标本进行检测。鼻咽抽吸物（NPA）传统上被认为是诊断呼吸道病毒感染的首选标本，在病毒检测中的检出率最高，常应用于甲型流感［12］，但是由于在收集NPA 时存在抽吸过程，有产生气溶胶的潜在风险，因此，不建议收集NPA 用于SARS-CoV-2检测［5］。鼻咽拭子（NPS）是NPA 的良好替代品，并且比口咽拭子的结果更可靠［13］。NPS 和口咽拭子现在是诊断COVID-19 活动性感染最常用的标本类型之一［5］。自行采集唾液标本的优点是不需要卫生保健专业人员采集，尤其是在个人防护设备短缺的情况下，采集唾液标本会减少给医护人员带来继发感染的风险。研究［5］表明，与鼻咽标本相比，自行采集的唾液标本的相对敏感性超过85%。由于方法和研究设计的异质性，世界卫生组织不建议使用唾液标本作为COVID-19 感染临床诊断的惟一标本类型［5］。与上呼吸道标本相比，下呼吸道标本具有更高的病毒载量，更有可能检出阳性结果［11］，建议在已经表现咳嗽的患者、COVID-19病程后期或临床高度怀疑但上呼吸道标本检测为阴性的患者中采集下呼吸道标本。自发产生的痰是最容易收集的下呼吸道标本；为了防止产生气溶胶的风险，不推荐诱导痰，避免使医护人员处于危险之中［5］。严格遵守感染控制指导的前提下，在闭环机械通气和适当的环境（例如通风良好的负压室）中，可从重症患者身上收集气管内抽吸物和支气管肺泡灌洗液。在极少数情况下可以在血浆中检测到SARS-CoV-2病毒核酸，可以将其视为重症至危重症的标志物［14］，但其辅助临床诊断的作用有限。另外，研究［14］发现，较大比例的COVID-19 患者粪便中存在SARS-CoV-2病毒，在病情较重的患者中和患病第二周后的概率更高。有研究［15］发现，肛拭子阳性与重症相关，可被视为严重疾病的警告指标。临床强烈怀疑COVID-19 但呼吸道标本核酸检测阴性的患者，也可以考虑采集粪便标本进行检测［5］。

在SARS-CoV-2大规模人群筛查和监测时，往往采用混合样本采集策略［16］。混采和混检都是为了提升检测效率，一般认为混采模式是既可以保证灵敏度又能提高检测效率的方式，但混检会随着混样数量的增加而降低分析灵敏度。值得注意的是，我国的研究［17］表明，混采引入的大量人基因组DNA 也会干扰提取和扩增效率，所以混采进行核酸检测时应注意加大样本提取体积、选择性能好的提取试剂和检测灵敏度高的扩增试剂、选择大模板量上样，才能提高检测灵敏度和稳定性，降低漏检风险。

采集标本的时间是影响检测结果准确性的另一个因素，因为病毒载量在感染后的不同天数会有所不同。因此，标本在采集时病毒载量低或采样过程不标准会导致假阴性结果。怀疑患病而初检阴性后24～48 h 可考虑复检，尤其是有下呼吸道感染证据时，可留存下呼吸道标本。有研究［5］建议始终谨慎解读实验室结果，当遇到检测结果与临床表现不符、Ct 值高或熔解曲线异常的弱阳性核酸检测结果、来自两种不同分析的结果相互矛盾时，应重新取样和重新检测，寻求参考实验室确认。阴性检测结果不一定排除感染，假阴性结果可能发生在分析前步骤（标本收集不当、采样不当）、分析步骤（PCR抑制、靶点突变）和分析后步骤（转录错误）［5］。对于诊断COVID-19，胸部CT 虽然特异性低，但其高灵敏度有助于纠正从RT-PCR获得的假阴性结果，RT-PCR和CT结合使用将提高灵敏度并提高检测效力［18］。

1.2 LAMP技术的应用 LAMP是一种基于PCR的核酸扩增，它能够在等温条件下非常有效、快速地特异性扩增目标序列。该方法依赖于使用四或六种不同的引物来识别目标基因上的特定四或六个区域，使用链置换DNA 聚合酶在恒温下延长链，是一种在60～65 ℃下运行的快速、高效和高特异性的扩增方法。LAMP 循环反应可在15～60 min 左右实现109～1010倍的目标拷贝［19］。这种方法的扩增可以在常规的水浴/加热模块中进行，并且可以通过添加荧光染料目视识别扩增产物。由于SARS-CoV-2 是RNA 病毒，因此需要逆转录LAMP（RT-LAMP）。RT-LAMP 是一种简单实用的技术，通过PCR 管中颜色、荧光或浊度的变化来分析结果。使用RT-LAMP进行SARS-CoV-2检测的优点是背景信号少、操作简单、检测更具特异性，并且不需要热循环仪［8］。另一方面，为了获得最佳检测限，RT-LAMP 在设计引物、优化时间和温度等方面还存在挑战。PARK 等［20］开发了RT-LAMP 方法，用于检测SARS-CoV-2 的Nsp3区域，该技术可以检测到低至100个拷贝的SARSCoV-2 RNA。YU 等［21］使用6 种靶向ORF1ab 基因的引物进行RT-LAMP，发现每个反应检测到SARSCoV-2 RNA 可低至10个拷贝。由于RT-LAMP 的准确性也会受到病毒引物结合区域突变的影响，所以在设计引物时需要避开这些突变位点，以提高检出率。尽管开发了许多基于RT-LAMP的分子技术，但由于分析中的交叉反应性，很少有人将其商业化［2］。

1.3 CRISPR 技术的应用 CRISPR 作为基因组编辑工具在科学界广受欢迎，CRISPR 和CRISPR 相关的Cas 蛋白具有许多潜在的应用，包括纠正遗传缺陷、治疗和预防疾病传播。它们在诊断应用中的潜力正在慢慢显现［2］。CRISPR 需要引导RNA 结合目标互补序列和核酸酶在精确位点切割。在病毒核酸检测时，称为向导RNA（gRNA）的小RNA 片段将依次与病毒基因的目标片段结合，然后使用特殊的CRISPR 相关核酸酶，如Cas9、Cas12 或Cas13 来切割目标分子，导致报告RNA 的裂解，产生检测信号。因此，CRISPR 技术成为检测SARS-CoV-2 的合理候选者。研究人员在CRISPR 系统的基础上设计了新颖的诊断方法用于检测SARS-CoV-2，包括高灵敏度酶促报告基因解锁（SHERLOCK）技术和DNA核酸内切酶靶向CRISPR 反式报告基因技术（DETECTR），为病毒感染提供基于CRISPR-Cas13 的快速准确检测分析［22］。SHERLOCK 是一种高特异度和高灵敏度的检测方法，因为Cas13 在目标RNA 中有两个或多个错配的情况下不会被激活，它可以轻松区分SARS-CoV-2和其他类似病毒；该技术的另一个优点是实验材料可以冷冻干燥运输。应用该项技术也存在挑战，如反应混合物和核苷酸的设计、多步核酸扩增等［8］。KAMINSKI 等［23］的报道表明，利用CRISPR技术可以实现在家中、护理点和现场的准确检测。

1.4 基因测序技术的应用 对感染患者临床标本的二代测序可以快速识别SARS-CoV-2。宏基因组测序方法不仅有助于病原体检测，还有助于提供遗传信息，从而进一步促进对病毒进化、分子流行病学和接触者追踪的分析。此外，基因测序使我们能够评估SARS-CoV-2的基因突变率，该信息对于确定抗病毒治疗效果和疫苗免疫效力非常有用［2］。

2 免疫学方法的应用

在许多情况下，通常需要不止一种检测来确认疾病，免疫学方法是分子生物学方法的有效补充。尽管RT-PCR 技术是检测SARS-CoV-2 活跃病例的最成熟技术，但由于采样时间、病毒标本处理不当等各种因素也可能出现假阴性结果，这些挑战促进了免疫学方法的开发［2］。研究人员和医疗公司已经研发了多种SARS-CoV-2免疫测定法，包括抗原检测技术、抗体检测技术、抗原抗体快速检测技术等，以识别COVID-19 患者体内是否存在相应的抗原或抗体。

2.1 抗原检测技术的应用 SARS-CoV-2基因组编码大约27种蛋白质，其中结构蛋白包括刺突糖蛋白（S）、膜糖蛋白（M）、包膜蛋白（E）和核衣壳蛋白（N）。S 蛋白已用于SARS-CoV-2 检测；N 蛋白约40 kDa，高丰度存在于临床标本中，是检测的理想候选者，也是最常选择的靶标［24］。抗原检测可测试呼吸道标本中是否存在SARS-CoV-2 病毒蛋白。大多数商品试剂盒需要从鼻腔或鼻咽部采集标本，有的还可使用唾液标本。检测技术主要利用免疫技术，如侧流夹心免疫测定、微流体免疫荧光测定和色谱数字免疫测定［5］。这些测试套装通常包括检测所需的所有材料，操作简单，可用作基于普通实验室的测试或即时检验（POCT），这种快速诊断测试可以在15～30 min内出结果。高度敏感和特异的抗原检测发展还存在一些挑战，第一个挑战是选择正确的抗体［25］，开发成功的抗体不仅需要对S 蛋白具有高亲和力，并且不会与其他冠状病毒的S 蛋白发生交叉反应；第二个挑战是信号强度，与分子生物学方法不同，抗原检测不会放大目标分子，因此与分子生物学检测相比，这些检测的灵敏度较低。此外，进行这些检测的最佳时间是病毒载量处于最高水平时。抗原检测的优点是操作简单，特别是在NAAT 测试的条件和可操作性有限的情况下以及对预计高病毒载量的患者进行测试时，可以选择抗原检测［5］。

2.2 抗体检测技术的应用 当SARS-CoV-2感染发生后，会触发机体免疫系统产生相应抗体。非定量抗体检测在流行病学调查中可以用于调查特定人群的发病率。相比之下，半定量或定量分析可以量化抗体产生水平进而检测抗体滴度的变化，虽然不是急性感染的首选检测方法，但可以在诊断急性感染中发挥作用。抗体检测分析通常针对两种SARS CoV-2 抗原，也就是N 或S 蛋白。基于实验室的检测，通常采用酶联免疫吸附检测（ELISA）和化学发光免疫检测（CLIA），也可使用侧流免疫测定法、胶体金或荧光标记技术［5］。COVID-19 患者抗体的血清学转换取决于症状的出现，因此进行检测的日期是一个重要因素［1］。ADNAN 等［26］研究显示，ELISA系统对Ct 值≤30 并在-80 ℃保存的样品显示出较高的灵敏度（92.9%），灵敏度随Ct 值和保持温度的增加成比例地降低，而特异性在98.3%～100%。通常在血清学检测中测定免疫球蛋白M（IgM）和免疫球蛋白G（IgG）这两种类型的抗体，也可以测定免疫球蛋白A（IgA）的存在和水平。IgA 主要存在于呼吸道和消化道等黏膜中，也可以在唾液、眼泪、血液、泌尿生殖道和鼻咽中找到［27］。IgM 抗体的存在表明最近有病毒感染，而IgG 抗体表明以前发生过SARSCoV-2 感染。因此，免疫分析对于针对COVID-19 的疫苗研究非常关键，也有助于确定没有活动性感染人群的感染程度。抗体的产生需要几天到几周的时间［5］。IgM 和IgA 的出现早于IgG，COVID-19 患者在症状出现5.5 d 后，IgM ELISA 的检测效率较高［28］。在一项对38项研究的系统评价中，评估了出现症状后的时间和抗体检测的敏感性之间的关联，发现IgM 在一周内检出率为23%，两周内检出率为58%，三周内检出率为75%；相应的IgG 检出率为30%、66%和88%［29］。另 一 研 究［30］表 明，IgG 阳 性 率 在16～20 d 时接近100%。抗体水平预计将在症状出现后大约三到四个星期达到峰值水平。因此，收集至少相隔14 d的配对血清进行半定量或定量分析可用于诊断近期感染。与轻度或无症状感染者相比，严重疾病者的抗体产生速度更快且水平更高［31］。在急性感染的情况下，可使用相隔2～4 周的配对血清样本来检测抗体滴度是否有四倍上升。然而，血清学检测不能作为急性SARS-CoV-2 感染的独立诊断方法［5］。目前尚不清楚SARS-CoV-2 特异性抗体在无症状个体中持续多久，有的无症状患者可能不发生血清学转换，因此，COVID-19 轻症或无症状感染者中可能无法检测到血清抗体。

2.3 抗原抗体快速检测技术的应用 快速检测、有效隔离有症状的病例以及系统地追踪密切接触者对于遏制SARS-CoV-2 感染的社区传播至关重要，因此，不断有检测SARS-CoV-2的快速试剂被研发。免疫快速抗原检测（RAD）特别适用于即时检测，因为它们无需设备即可轻松执行和报告，价格低廉，并且可以缩短周转时间。然而，RAD 检测灵敏度的研究报道各不相同，可能与患者临床特征和年龄、检测地点、处理的标本类型和测试时间等不同有关［32］。许多实验室报告了基于侧流免疫层析技术的血清学检测方法，主要以胶体金为示踪剂，检测患者血清、尿液、口腔液等生物标本中的病原体抗原或其特异性抗体［1］。与RT-PCR 技术不同，抗原抗体快速检测技术在性能和灵敏度方面存在局限性。床旁形式的血清学检测主要用于社区内的监测。然而，对这些快速测试的放松管制或滥用会在社会上造成额外的恐慌。

3 其他检测技术的应用

近期各种新的检测研究不断被研发报道。有研究［33］描述了一种基于涂有His 标记的SARS-CoV-2抗原的Ni2+磁性颗粒和96 孔板，用于检测人类SARS-CoV-2 血清学转换，是一种超快速、高通量和廉价的检测方法，允许同时分析96个样品并在7 min 内提供高精度结果。基于生物识别和电化学信号转导相结合的平台，即生物电化学平台，为感知和研究SARS-CoV-2 提供了独特的机会［34］。SHARMA 等［35］的研究揭示了氧化石墨烯釉面双叉指电容（DIDC）生物传感平台在检测SARS-CoV-2 S1蛋白方面具有的前景，可适用于即时诊断应用。

综上所述，基于核酸和抗原/抗体的检测可用于SARS-CoV-2 感染分析。核酸检测或抗原检测可用于诊断目的，抗体检测可用于评估病毒暴露或人群的血清监测。不同检测技术的灵敏度差异很大。大多数基于核酸的检测使用两个基因目标，RT-PCR技术仍然是检测SARS-CoV-2 感染的金标准技术。核酸检测的结果也取决于所使用的标本和感染的阶段。准确及时检测SARS-CoV-2，可以有效预防和管理COVID-19病例并遏制其传播。