碱胁迫对银杏内生菌Lysinibacillus sphaericus Ya6产胞外多糖的影响

陈 久 梁， 叶 淑 红， 郭 磊

( 1.大连工业大学 食品学院, 辽宁 大连 116034；2.中华人民共和国大窑湾海关， 辽宁 大连 116601 )

0 引 言

植物内生菌是指生活在健康植物组织或细胞内并对宿主植物不引起明显病害症状的一类微生物群[1]。植物内生菌是一个新的、巨大的微生物资源库，对其研究对农业、医药、工业等领域都有着重要意义[2]。细菌胞外多糖(EPS)是一种主要参与细胞黏附和保护的多糖，它或与细胞表面以囊状共价结合，或分泌到细胞外环境中。由于其结构和功能特性的多样，EPS被广泛应用于食品、医药、工业等领域中[3]。研究发现，内生菌与宿主的“协同进化”关系决定了某些内生菌具有产生与宿主植物相同或相似的生物活性物质的能力，具有一定的生物活性。向达兵等[4]发现苦荞植株中分离出的内生真菌，经其多糖处理的苦荞苗的质量、叶面积、茎粗及叶绿素含量均显著增加，植株更加健壮；华栋[5]研究发现绿绒蒿内生真菌多糖拥有一定的抗氧化活性。微生物在实际生产应用中往往会面对诸多逆境胁迫。为保护自身，生物体在逆境环境中会产生多种应激反应和生理特性变化[6-7]。研究微生物在逆境下的活性代谢产物变化对于微生物应用、诱导新型化合物的产生等具有重要意义。

菌株LysinibacillussphaericusYa6是从健康的银杏叶芽中分离并经过初步筛选后得到的银杏内生菌，经鉴定，为球形赖氨酸芽孢杆菌(GenBank号KY565423.1)。前期实验已证实其可在碱性条件下生长，当pH为10时，生长开始出现明显减慢。本实验研究了在不同程度碱胁迫下内生菌LysinibacillussphaericusYa6胞外多糖的结构和生理特性变化。

1 材料与方法

1.1 材 料

实验菌株LysinibacillussphaericusYa6，从大连工业大学校园内银杏树中分离得到一株植物内生菌，由本实验室纯化并保藏。采用牛肉膏蛋白胨培养基(牛肉膏0.5%，蛋白胨1.0%，NaCl 0.5%，葡萄糖0.5%，pH 7.2～7.4)进行活化。发酵培养基为蔗糖120 g/L，酵母浸粉8 g/L，氯化钠5 g/L，磷酸氢二钾1 g/L，氯化钾1 g/L，pH分别为8、9、10。

1.2 方 法

1.2.1 胞外多糖的提取与纯化

菌株接入活化培养基中，28 ℃培养18 h后以2%的接种量转接于发酵培养基，28 ℃摇瓶培养18 h(转接两次)。培养至对数生长期，用无菌水调整菌液OD600为0.8，以2%的接种量接种于相应的发酵培养基中，28 ℃摇瓶培养54 h后进行巴氏灭菌。发酵液于8 000 r/min离心15 min，收集上清液进行旋转蒸发以使其浓缩后加入4倍体积的无水乙醇，4 ℃静置过夜。离心收集沉淀的胞外多糖(EPS)加适量去离子水溶解，用Sevag法去除蛋白。将经过脱蛋白处理的EPS溶液装入透析袋中，截留分子质量8～14 ku的蛋白；自来水流水透析48 h后蒸馏水透析48 h。将透析后的溶液8 000 r/min离心15 min去除沉淀，浓缩、冷冻干燥得到粗EPS。

用DEAE-52纤维素和Sephadex G-100凝胶对EPS进行纯化。将洗脱液浓缩、透析、冻干，得到纯化后的EPS，分别命名为EPSoc、EPS8、EPS9、EPS10

1.2.2 超氧阴离子清除率测定

将0.05 mol/L的Tris-HCL缓冲液(pH=8.2)和7 mmol/L的焦性没食子酸溶液于25 ℃水浴预热20 min。分别取0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL不同质量浓度的样液1 mL，加入Tris-HCL缓冲液4.5 mL和焦性没食子酸溶液0.4 mL。混合体系于25 ℃精确反应4 min后滴加2滴10 mol/L浓盐酸终止反应。在320 nm处测定吸光度，用蒸馏水代替焦性没食子酸溶液作对照组，用蒸馏水代替样品溶液作空白组，用抗坏血酸溶液代替样品溶液作为阳性对照组。该实验平行重复3次，取平均值[8]。

样品对超氧阴离子的清除率按照式(1)计算：

清除率=[1-(A0-A1)/A2]×100%

(1)

式中：A0、A1、A2分别为样品组、对照组、空白组在320 nm处的吸光度。

1.2.3 羟自由基清除率测定

分别取0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL不同质量浓度的样液1 mL，加入9 mmol/L硫酸亚铁溶液1 mL、9 mmol/L水杨酸-乙醇溶液1 mL和8.8 mmol/L过氧化氢溶液1 mL。反应体系混合均匀后于37 ℃下反应30 min。在510 nm处测定吸光度，用蒸馏水代替过氧化氢溶液作为对照组，用蒸馏水代替样品溶液作为空白组，用抗坏血酸溶液代替样品溶液作为阳性对照组。实验平行重复3次，取平均值[9]。

样品对羟自由基的清除率按照式(2)计算：

清除率=[1-(A′0-A′1)/A′2]×100%

(2)

式中：A′0、A′1、A′2分别为样品组、对照组、空白组在510 nm处的吸光度。

1.2.4 DPPH自由基清除率的测定

分别取0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL不同质量浓度的样液2 mL，加入0.26 μmol/L的DPPH乙醇溶液2 mL。该反应体系混合均匀后避光反应30 min。在517 nm处测定吸光度，用无水乙醇代替DPPH溶液作为对照组，用无水乙醇代替样品溶液作为空白组，用抗坏血酸溶液代替样品溶液作为阳性对照组。该实验平行重复3次，取平均值[10]。

样品对DPPH自由基的清除率按照式(3)计算：

清除率=[1-(A″0-A″1)/A″2]×100%

(3)

式中：A″0、A″1、A″2分别为样品组、对照组、空白组在517 nm处的吸光度。

1.2.5 紫外光谱分析

将纯化后的EPS样品配制成0.1 mg/mL的溶液，用紫外可见分光光度计在190～400 nm进行扫描。

1.2.6 红外光谱分析

将纯化后的EPS样品分别与KBr粉末混合研磨，用压片机压制成片，在4 000～400 cm-1进行扫描。

1.2.7 硫酸根含量的测定

采用硫酸钡比浊法测定样品中硫酸根的含量。分别配制质量浓度0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mg/mL的硫酸钾溶液。称取明胶0.25 g，用少量热水溶解后定容至50 mL，4 ℃静置过夜后加入0.25 g氯化钡，4 ℃保存。分别取各浓度硫酸钾溶液2 mL，加入3 mL氯化钡-明胶水溶液，混合均匀后于360 nm测定吸光度。以硫酸钾浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线并得到回归方程。

称取EPS 2 mg，与2 mol/L三氟乙酸2 mL一起注入安瓿，充入保护性气体后用酒精喷灯加热密封，于110 ℃烘箱内水解2 h。取反应后混合物2 mL测定吸光度，计算样品的硫酸根含量。

2 结果与讨论

2.1 超氧阴离子清除率

样品清除超氧阴离子生成的能力如图1所示，以在最适条件下培养菌株所得的胞外多糖为对照，以抗坏血酸(VC)为阳性对照。从图1可以看出，超氧阴离子清除率与多糖浓度有一定的浓度依赖性。在碱胁迫时，与其他样品相比，EPS10在1.0～2.5 mg/mL超氧阴离子清除率最强，在质量浓度2.5 mg/mL时，其超氧阴离子清除率达到35.59%。EPS8和EPS9在质量浓度为2.5 mg/mL时的超氧阴离子清除率也超过了EPSoc，分别达到了29.72%和28.92%。EPSoc、EPS8、EPS9、EPS10清除超氧阴离子的EC50分别为11.224、10.720、5.926、3.790 mg/mL。

图1 碱胁迫条件下Lysinibacillus sphaericus Ya6所产胞外多糖的超氧阴离子清除能力

2.2 羟自由基清除率

样品的羟自由基清除能力如图2所示。以在最适条件下培养菌株所得的胞外多糖为对照，以抗坏血酸(VC)为阳性对照。由图2可知，菌株在碱胁迫条件下菌株产胞外多糖的羟自由基清除能力远低于抗坏血酸，但强于最适条件下产胞外多糖的羟自由基清除能力。其中EPS10羟自由基清除能力最强。EPSoc、EPS8、EPS9、EPS10清除羟自由基的EC50分别为28.171、21.479、25.192、26.536 mg/mL。

图2 碱胁迫条件下Lysinibacillus sphaericusYa6产胞外多糖的羟自由基清除能力

2.3 DPPH自由基清除率

样品的DPPH自由基清除能力如图3所示。以最适条件下培养菌株所得的胞外多糖为对照，以抗坏血酸(VC)为阳性对照。如图3所示，在碱胁迫条件下，菌株所产的胞外多糖表现出了较强的DPPH自由基清除活力，在0.5～2.5 mg/mL，各实验组样品的DPPH自由基清除能力均强于对照组，其中EPS10的DPPH自由基清除能力最佳，在质量浓度2.5 mg/mL时达到95.65%。EPSoc、EPS8、EPS9、EPS10清除DPPH自由基的EC50分别为2.975、0.996、0.936、0.903 mg/mL。

图3 碱胁迫条件下Lysinibacillus sphaericusYa6所产胞外多糖的DPPH清除能力

2.4 紫外光谱分析

各样品在190～400 nm的扫描结果如图4所示。各样品在260和280 nm处无紫外吸收，表明样品中不含核酸和蛋白质[11]。

图4 碱胁迫下Lysinibacillus sphaericus Ya6产胞外多糖的紫外扫描光谱

2.5 红外光谱分析

图5 碱胁迫下Lysinibacillus sphaericus Ya6产胞外多糖的红外扫描光谱

本实验各样品的红外光谱大体相似，均出现了典型的多糖特征吸收峰，且存在甘露糖-吡喃糖结构，但吸收峰强度、位置存在差异，说明它们的成分含量不同。

2.6 硫酸根含量

EPS各样品中的硫酸根含量如表1所示。

表1 EPS中硫酸根的质量分数

在碱胁迫条件下，菌株所产胞外多糖的硫酸根含量随培养基pH的升高而增加。研究表明，硫酸多糖具有良好的DPPH自由基清除能力[18-20]。这与本研究得出的结果一致。

3 结 论

碱胁迫使LysinibacillussphaericusYa6产胞外多糖对超氧阴离子、羟自由基的清除能力有所提升；对DPPH自由基清除能力显著提升，pH为10时，胞外多糖的DPPH自由基清除率高达95.65%。紫外光谱分析发现各样品在260和280 nm处无紫外吸收，表明样品中不含核酸和蛋白质；红外光谱分析表明各多糖样品均存在典型的多糖特征吸收峰，且存在甘露糖-吡喃糖结构，但吸收峰强度、位置存在差异。菌株所产胞外多糖的硫酸根含量随培养基pH的升高而增加。