铁死亡与视网膜疾病的相关性研究进展△

董 欣

视网膜疾病中往往存在视网膜色素上皮细胞(RPE)、视网膜神经节细胞(RGC)等视网膜细胞的死亡，视网膜细胞死亡是导致视功能损害的主要原因。阐明视网膜细胞死亡的分子机制能够为视网膜疾病的预防和治疗提供新思路和新视角，具有重要的理论意义和实用价值。传统观点认为细胞死亡包括细胞坏死和细胞凋亡[1]，然而，随着细胞死亡相关研究的不断深入，新的细胞死亡方式也逐渐被发现，其中铁死亡是铁依赖性、非凋亡性的细胞死亡形式[2]。近年来，铁死亡与视网膜疾病的关系受到越来越多的关注。本文就铁死亡的分子机制及其在视网膜疾病中的作用进行综述，以期为视网膜疾病的治疗提供新方向。

1 铁死亡概述

1.1 铁死亡的特征铁死亡概念由Dixon等[3]于2012年首次提出，是以质膜不饱和脂肪酸消耗和铁诱导的脂质活性氧(ROS)积累为特点的调节性细胞死亡[2]。铁死亡的形态特征和生化特征均不同于细胞凋亡、坏死和自噬等其他细胞死亡方式。在形态特征上，铁死亡细胞不具有染色质凝集等细胞凋亡特征，也没有细胞质和细胞器肿胀及质膜破裂等细胞坏死特征，同时也不具备形成双层膜封闭囊泡的特点[3]，但是，在电子显微镜下可以观察到铁死亡细胞的线粒体收缩变小、嵴减少、线粒体膜密度增加、外膜破裂，而其他细胞死亡形式的线粒体肿胀变大[1-3]。在生物化学特征上，铁死亡主要与铁积累和脂质过氧化相关，而细胞凋亡、自噬、坏死性凋亡分别与DNA片段化、溶酶体活性增加、三磷酸腺苷(ATP)水平下降有关[4]。

1.2 铁死亡的分子机制铁诱导的脂质ROS积累是诱发铁死亡的关键因素[2]。目前认为以下3种途径可能参与铁诱导的脂质ROS积累。

1.2.1 铁离子介导的ROS生成途径铁是体内重要的微量元素，其分布异常或者含量异常均会影响正常的生理过程[4]。细胞中有Fe2+和Fe3+两种形式的铁，其中Fe2+可以作为蛋白质的辅因子或者催化剂参与各种氧化应激反应，而Fe3+是铁离子运输和储存的主要形式[5]。在正常生理状态下，机体通过调控铁摄取、铁储存和铁输出等相关通路蛋白的功能以维持铁稳态。然而，在视网膜色素变性等病理条件下，铁稳态被破坏，导致Fe2+过量积累[6]，过量的Fe2+与细胞中的H2O2通过芬顿反应氧化多不饱和脂肪酸(PUFA)等有机物并直接生成脂质ROS，导致脂质过氧化并进而诱发铁死亡[5,7-8]。这表明铁离子在脂质ROS生成和铁死亡中具有重要作用。

1.2.2 含铁酶介导的ROS生成途径细胞中的含铁酶包括脂肪氧化酶(LOX)、细胞色素氧化酶和过氧化氢酶等，其中LOX可能参与铁死亡进程。在LOX介导的ROS生成途径中，PUFA经酰基辅酶A合成酶长链家族成员4(ACSL4)和溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶3(LPCAT3)两步催化反应后生成多聚(PL)-PUFA(PE)，随后PL-PUFA(PE)被LOX氧化为具有细胞毒性的脂质过氧化物PL-PUFA(PE)-OOH。PL-PUFA(PE)-OOH在谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)催化下可转变成无毒性的脂肪醇PL-PUFA(PE)-OH，然而GPX4活性不足或者表达降低则导致PL-PUFA(PE)-OOH过量积累进而促进ROS生成并诱发铁死亡。

1.2.3 抗氧化系统介导的ROS生成途径除铁离子以及含铁酶诱导的ROS生成外，细胞的抗氧化系统失活也是导致ROS生成的重要途径[9]。研究表明，谷胱甘肽(GSH)是细胞抗氧化系统的重要构成部分[9]，其水平升高能抑制ROS积累和脂质过氧化[10]，而GSH合成减少是铁死亡的主要原因之一[11]。GSH由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成，其中半胱氨酸是GSH合成的限速前体[9]。半胱氨酸通过胱氨酸/谷氨酸逆向转运体(system Xc-)以其氧化形式胱氨酸进入细胞并立即被还原成半胱氨酸[9]，抑制胱氨酸的摄取导致半胱氨酸水平降低以及GSH合成下降[5]，这表明，system Xc-可能是GSH生成的限制因素。system Xc-是由溶质载体家族7成员11(SLC7A11)和溶质载体家族3成员2(SLC3A2)组成的异二聚体[9]，以ATP依赖性的方式将细胞中的谷氨酸排出细胞，同时将胞外的胱氨酸运入细胞[5]。以上研究显示，抑制system Xc-可能会阻碍胱氨酸的摄取，导致GSH水平降低，进而抑制细胞的抗氧化能力并最终引起细胞死亡。

众所周知，GSH的巯基具有还原能力因而能够直接发挥抗氧化作用，然而GSH是如何在铁离子及含铁酶介导的脂质过氧化中发挥抗氧化作用的这一点并不清楚。有研究表明，GSH可作为GPX4的辅助因子调节GPX4的活性，GSH水平下降导致GPX4活性降低，GSH耗竭致使GPX4失活，因而GSH的可用性决定了GPX4的活性[5]。GPX4是一种含硒抗氧化酶，也是细胞抗氧化系统的重要组成部分[9]，可通过乒乓机制[9]淬灭磷脂氢过氧化物进而抑制脂质ROS的生成，GPX4活性受到抑制导致脂质ROS快速积累[12]，因而其活性下降是铁死亡的主要原因之一[11]。

综上所述，抑制system Xc-可阻碍胱氨酸的摄取，减少GSH的合成，致使GSH水平下降，导致GPX4活性降低，GPX4活性下降抑制了其淬灭磷脂氢过氧化物的能力，引起脂质ROS积累并最终导致细胞死亡。

1.3 铁死亡的诱导剂和抑制剂铁死亡在不同疾病中具有不同的生物学功能，比如促进肿瘤细胞的铁死亡有利于保护机体，而视网膜细胞的铁死亡则对机体有害，因此探讨铁死亡的诱导剂和抑制剂具有重要的意义。

1.3.1 铁死亡诱导剂Erastin是首个被报道的铁死亡诱导剂，可通过抑制system Xc-活性导致细胞的抗氧化系统失活并最终导致细胞铁死亡[3]，同时也能结合线粒体电压依赖性阴离子通道促进线粒体去极化，诱导线粒体功能障碍并导致细胞死亡[13-14]。有研究发现，Erastin能够诱导肝癌细胞、结直肠癌细胞的铁死亡，并且Erastin与顺铂等抗癌药物联合治疗能增强药物的抗肿瘤作用[15-16]，这表明，Erastin在抗肿瘤治疗中具有巨大潜力。与Erastin的作用机制类似，柳氮磺吡啶[3,17]、索拉非尼[17]和谷氨酸盐[3,17]也通过抑制system Xc-活性促进细胞铁死亡。虽然柳氮磺吡啶、索拉非尼、谷氨酸盐和Erastin在体外均展现出促进肿瘤细胞铁死亡的功效，但是这些铁死亡诱导剂具有代谢稳定性差、水溶性不佳以及效力差的缺点，因而无法在体内使用[18]。为克服这一弊端，部分研究采用多种技术手段制备了具有高稳定性、高水溶性且在体外和体内均可以诱导肿瘤细胞铁死亡的Erastin衍生物——咪唑酮Erastin[18]，然而咪唑酮Erastin能否在临床上应用还有待进一步确定。

1.3.2 铁死亡抑制剂铁死亡诱导剂主要调控system Xc-活性以及线粒体电压依赖性阴离子通道，而铁死亡抑制剂主要通过调节铁稳态、影响LOX活性、调控GPX4水平，并清除ROS抑制脂质过氧化等多种机制抑制铁死亡[3]。Ferrostatin-1 (Fer-1)是一种选择性的铁死亡抑制剂。Dixon等[3]研究发现，在大鼠海马切片培养模型中，高浓度谷氨酶(Glu)会引发大量细胞死亡，而Fer-1能抑制这种死亡，进一步的机制研究表明，Fer-1可能通过抑制Erastin诱导的脂质ROS积累进而减少铁死亡。另有研究显示，Fer-1能够抑制膜脂PUFA的氧化，进而抑制细胞死亡[19]。有研究显示，抑制铁死亡在亨廷顿病[19]、脑室周围白质软化[19]、肾小管坏死[20]等多种疾病中具有保护作用，然而Fer-1的血浆稳定性差[20]，治疗效果有待提升，因而有必要研发新的铁死亡抑制剂。有研究基于Fer-1的结构信息研发出了具有高血浆稳定性、高代谢稳定性的铁死亡抑制剂16-86，动物实验表明，16-86对肾缺血-再灌注损伤小鼠的保护作用优于Fer-1[20]。另有研究从天然产物库中筛选到了黄芩素[21]等铁死亡抑制剂并进行了机制研究，结果显示，黄芩素通过抑制Erastin诱导的亚铁生成、GSH消耗、脂质过氧化以及GPX4的降解增强了细胞抗铁死亡的能力[21]。此外，有研究还检测了硫辛酸等常用的抗氧化剂在铁死亡中的作用，结果表明，硫辛酸主要通过抑制铁死亡来预防叶酸引起的肾损伤，并且硫酸锌还具有螯合过量铁离子、清除ROS的功能[10]。虽然铁死亡抑制剂对铁死亡介导的疾病具有较好的治疗效果，但是目前的研究多限于基础研究，这些抑制剂能否在临床上达到相同的效果还有待进一步确认。

2 铁死亡与视网膜疾病

铁死亡相关研究最早起始于肿瘤，然而近些年来，学者们开始逐渐关注铁死亡与眼科疾病的关系。现就铁死亡在年龄相关性黄斑变性(AMD)、视网膜色素变性(RP)、糖尿病视网膜病变(DR)和视网膜缺血-再灌注等视网膜疾病中的发现进行介绍。

2.1 铁死亡与AMDAMD是一种黄斑神经退行性疾病[22]，也是导致老年人群不可逆性失明的主要原因[23]。AMD的潜在机制包括氧化应激介导的RPE细胞死亡和随后的光感受器细胞死亡[24]。既往研究认为，细胞凋亡是RPE/光感受器细胞死亡的主要原因[24]。然而，近年来的研究表明，铁死亡也是导致AMD的重要因素之一[22]。有研究显示，AMD患者RPE和神经视网膜中存在铁积累现象[25-26]，铁积累会导致视网膜氧化应激和脂质过氧化[24]，而向小鼠玻璃体内注射铁也会导致急性光感受器细胞死亡、脂质过氧化[27]，并且脂质过氧化是AMD的特征之一[24]，结合铁积累和脂质过氧化是铁死亡生化特征的文献报道，有研究推测铁死亡可能参与AMD发病[22，28]。Totsuka等[22]采用叔丁基氢过氧化物(tBH)诱导建立AMD体外细胞模型并检测细胞的铁死亡相关特征，结果显示，tBH诱导的RPE细胞死亡伴随着脂质过氧化产物增加、GSH消耗增加、Fe2+积累等铁死亡的特征以及铁代谢基因失调的现象，采用铁死亡抑制剂Fer-1和去铁胺均可显著抑制上述特征，并且铁死亡抑制剂比细胞凋亡和坏死性凋亡抑制剂的效果更好，该研究证明了铁死亡参与AMD发病。Wei等[28]从体内和体外两个水平进一步证明了铁死亡在AMD中的重要性，动物实验结果显示，碘酸钠诱导的AMD动物模型存在铁死亡相关特征，并且采用铁死亡抑制剂能够逆转上述现象；与动物实验结果相同，细胞实验结果也显示，干扰素-γ能够导致RPE细胞铁死亡，进一步的机制研究表明，干扰素-γ可能通过降低GPX4水平并阻断system Xc-诱导GSH消耗促进的细胞铁死亡， 这与Totsuka等[22]的研究结果类似。此后，其他研究也相继报道了AMD病变中的铁死亡现象[29]。由于铁死亡在AMD进程中的重要作用，因而有必要探讨铁死亡药剂在AMD治疗中的疗效，然而，目前仅有少量研究报道了铁死亡制剂在治疗AMD动物中的效果[29]，并且迄今为止尚无文献报道铁死亡制剂在临床水平上改善AMD的功能。

2.2 铁死亡与RPRP是全球最常见的遗传性和非营养性视网膜退行性疾病[30]，视杆细胞、视锥细胞等光感受器细胞死亡和RPE细胞丢失是导致RP的重要原因[30]。然而，目前尚无有效治疗RP的方法[31]。据报道，RP小鼠模型中存在铁代谢功能障碍及其导致的铁过载现象，并且转铁蛋白及其受体的表达随着铁水平的增加而上调[6]。同时，RP小鼠视网膜组织中脂质过氧化标志物4-羟基-2-壬烯醛的表达水平显著增加[6]。此外，向小鼠玻璃体内注射Fe2+不仅可诱导光感受器细胞死亡而且诱导光感受器中超氧自由基的产生和脂质过氧化，并且视锥细胞比视杆细胞更容易受到铁死亡诱导的氧化损伤[32]，进一步的研究表明，向玻璃体内注射Fe2+还能增加4-羟基-2-壬烯醛表达、降低GPx-4水平[33]。以上研究显示，铁死亡可能与RP有关。Liu等[34]采用碘酸钠诱导RPE细胞建立的RP细胞模型进一步证明了RP与铁死亡的相关性，该研究发现，RPE细胞死亡过程伴随着Fe2+、ROS、脂质过氧化物水平显著增加，并且采用去铁胺甲磺酸盐、Fer-1等铁死亡抑制剂能抑制碘酸钠诱导的细胞死亡，进一步的机制研究表明，碘酸钠能够消耗GSH、增加ROS水平、促进铁储存蛋白中螯合铁的释放，进而促进脂质损伤并导致RPE细胞铁死亡。与Liu等[34]的结论类似，Tang等[35]的研究也显示，铁死亡是导致RP的关键因素，并提出血红素加氧酶-1(HO-1)可能是调控RP的关键分子，结合体外和体内实验，该研究证实了抑制HO-1表达可能通过减少Fe2+积累来抑制RPE及光感受器细胞变性的机制。基于以上研究结果，采用抑制铁积累、增加抗氧化剂水平并减少脂质过氧化等手段抑制铁死亡可能有助于治疗RP。

2.3 铁死亡与DR最近，有研究发现，在糖尿病小鼠模型的视网膜中存在铁累积现象，而在通过敲除血色素沉着症蛋白(HFE)建立的铁超载小鼠模型中诱导糖尿病，与野生型诱导的糖尿病小鼠相比，其神经元死亡增加，血管变性增加，视网膜屏障受损，出现严重DR症状[36]。研究发现，在糖尿病患眼中，铁稳态失衡导致铁超载，引起视网膜神经性病变，RPE细胞吞噬功能缺陷，自身抗原积累，促炎因子合成，进一步导致视网膜功能受损[37]，这表明，视网膜中铁稳态与视网膜功能密切相关。以上研究证实了铁在视网膜功能和DR发生发展中起重要作用，结合DR中氧化应激是其诱导因素，提示DR中很可能有铁死亡的发生。

2.4 铁死亡与视网膜缺血-再灌注视网膜缺血-再灌注在急性青光眼、DR、缺血性视神经病变、高血压性视网膜病变和视网膜血管阻塞等视力障碍中均有发生。在视网膜缺血-再灌注中，视网膜脉管系统中血流量减少(缺血)会导致视网膜对氧气和其他营养物质过敏，当随后恢复循环(再灌注)时会导致严重的氧化和炎症损伤，包括ROS和炎性细胞因子的过载、血管通透性增加、钙内流、RGC细胞凋亡和逆行神经营养因子运输受损[38]。视网膜缺血-再灌注小鼠模型中超氧离子、过氧化氢和4-羟基壬烯醛蛋白修饰增加且视网膜细胞凋亡水平升高[39]，并且视网膜缺血-再灌注也能导致大鼠视网膜中ROS水平上升[40]，这表明，视网膜缺血-再灌注能够导致ROS产生和细胞凋亡。铁螯合剂去铁胺能够改善视网膜缺血-再灌注损伤[41]，并且具有铁死亡抑制剂功能的黄芩素也能够通过发挥抗氧化作用改善视网膜缺血损伤[42]。摄入铁可能会增加患青光眼的风险[43]，同时在青光眼患者和青光眼小鼠模型中，RGC的线粒体更小、更圆、更碎片化，提示青光眼可能与铁含量、线粒体缺陷有关[44]。Dexras1是由一氧化氮激活的一种小G蛋白，Dexras1可促进细胞铁死亡，小鼠中Dexras1的缺失抑制了实验性青光眼和视神经炎中RGC的死亡[45]，表明铁死亡可能在RGC死亡中起重要作用。

3 展望

铁死亡是一种新的细胞死亡形式，可能参与AMD、RP、DR和视网膜缺血-再灌注等多种视网膜疾病以及癌症的发生发展过程。近年来，虽然，较多研究对铁死亡相关机制进行了探索，但是迄今为止仍然无法回答为何是铁而不是锌等其他金属离子诱导细胞死亡等问题。此外，铁死亡是否参与视网膜缺血-再灌注损伤及其可能的调控机制也未见报道，因而，铁死亡的具体机制及其在视网膜疾病中的作用仍待进一步探讨。此外，尽管已有多种铁死亡抑制剂和诱导剂被研发出来，但均是在细胞和动物模型中进行的，因而铁死亡制剂的临床治疗尚待进一步探究。