葛根、姜黄、沙棘提取物复合护肝功效研究*

潘 钰，夏海华，于 冲，曲晓军，尹丽颖，叶 阳△

(1.黑龙江省科学院微生物研究所微生物药物学中心，黑龙江 哈尔滨 150010；2.黑龙江中医药大学实验实训中心，黑龙江 哈尔滨 150036)

卫计委公布的《既是食品又是药品的物品名单》中：葛根、姜黄、沙棘均有文献报道具有护肝作用，他们均为药食同源植物，他们的主要护肝作用成分分别为葛根素、姜黄素、沙棘黄酮或多糖[1-5]。三者可能通过不同的机制起到减轻肝损伤作用，葛根素能抑制甘油三酯合成，具有解酒护肝等功效作用[6]；姜黄素对肝脏疾病症状的预防和改善作用源于其抗氧化、抗炎症作用，其护肝作用主要在于抑制肝纤维化[7]；抗氧化也是多种沙棘活性成分的重要特性，沙棘黄酮具有良好的自由基清除能力及抑制脂质过氧化作用[8]。

本研究旨在通过建立CCl4小鼠肝损伤模型，将文献报道过有护肝作用的“既是食品又是药品”的葛根、姜黄、沙棘有效成分组成复方，探究复方对小鼠化学性肝损伤的辅助保护作用，以期为进一步开发对化学性肝损伤具有综合作用的保健食品提供一定的理论依据和参考。

1 材料与方法

1.1 材料 葛根素，姜黄素，购自西安瑞林科技有限公司；沙棘黄酮，购自陕西冠晨生物科技有限公司；谷丙转氨酶(AlanineTransaminase，ALT)、谷草转氨酶(AspartateTransaminase，AST)、丙二醛(MaleicDialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(SuperoxideDismutase，SOD)、还原型谷胱甘肽(Glutathione，GSH)、甘油三酯(Triglyceride，TG)、总胆固醇(TotalCholesterol，TCHO)测定试剂盒，购自江苏南京建成生物工程研究所；Bradford蛋白浓度测定试剂盒，购自北京索莱宝科技有限公司；四氯化碳(CarbonTetrachloride，CCl4)，购自中国天津富裕华工有限公司。

1.2 动物实验 雄性昆明种小鼠(KM)，购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所。将小鼠养在动物室中，自由进食、饮水，给予标准颗粒饲料，控制温度为20～22 ℃，相对湿度为55±10%，光照/黑暗循环为12 h。在适应一周后开始动物实验。所有程序均符合实验动物护理和使用指南。

称重60只小鼠，随机分为6组，即空白对照组(Control)，四氯化碳模型组(Model)，葛根素组(Puerarin，简写成Pue)、姜黄素组(Curcumin，简写成Cur)、沙棘黄酮组(Seabuckthornflavonoids，简写成Seaf)、复方组(葛根素、姜黄素和沙棘黄酮含量1∶1∶1，简写成Pue+Cur+Seaf)，葛根素组(Pue)，姜黄素组(Cur)，沙棘黄酮组(Seaf)各组中分别将各材料溶解在蒸馏水中，并使用圆头喂食针口服给予小鼠。葛根素，姜黄素，沙棘黄酮组中的小鼠给药剂量为300 mg/kg·d的相应材料，复方组中三种材料的剂量均为100 mg/kg·d(总量为300 mg/kg·d)，连续15 d，空白对照组和四氯化碳模型组中的小鼠接受等体积的蒸馏水。第15在d，急性肝损伤通过灌胃CCl4(0.4 mL，40%，溶于橄榄油)建立模型，空白对照组小鼠灌胃等量的橄榄油。禁食不禁水16 h后，称重，用眼科镊子摘取小鼠眼球采血，采用颈椎脱臼方法处死小鼠，剖开腹腔分离完整肝脏并称重，计算肝脏/体重比率，即肝指数。小鼠血液静置2 h后，通过离心(3000 rpm，10 min)获得血清样品，并在-80 ℃下储存直至测定。收获肝组织并将部分肝脏样品固定在2.5%戊二醛溶液中用于组织学分析，将剩余的肝脏样品立即浸入液氮中并储存在-80 ℃直至使用。

1.3 血清酶分析 按试剂盒说明测定血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)含量。

1.4 肝脏指标测定 肝脏制备10%肝匀浆，用Bradford蛋白浓度测定试剂盒测定匀浆液蛋白质浓度，按试剂盒说明操作检测小鼠肝组织中SOD的活性及MDA、GSH、TG和TCHO的含量。

1.5 组织病理学观察 将小鼠肝脏切成0.5～1 mm3的小块，将样品块浸入2.5%戊二醛溶液，制作超薄切片后用透射电镜观察各组肝脏切片。

2 结果

2.1 复方对CCl4急性肝损伤小鼠肝指数的影响 肝指数是一与肝脏损伤程度呈正相关的大体指标。与空白对照组相比，四氯化碳模型组小鼠肝指数显著升高(P<0.05)。表明小鼠四氯化碳急性肝损伤模型造模成功。各组均可显著降低四氯化碳所致急性肝损伤小鼠肝指数(P<0.05或P<0.01)；复方组和葛根素组、沙棘黄酮组比较，能更显著降低肝指数(P<0.05)(图1)。

图1 各组对CCl4急性肝损伤小鼠肝脏指数的影响

2.2 复方对CCl4急性肝损伤小鼠血清指标AST、ALT活性的影响 与空白组相比，四氯化碳模型组小鼠血清ALT、AST显著升高(P<0.01)，表明小鼠四氯化碳急性肝损伤模型造模成功。葛根素组，姜黄素组均可显著降低四氯化碳所致急性肝损伤小鼠血清ALT和AST(P<0.05或P<0.01)。沙棘黄酮组虽可显著降低四氯化碳所致急性肝损伤小鼠血清AST(P<0.01)，降低ALT无显著差异(P>0.05)。研究发现，复方能使小鼠血清中ALT、AST活性升高的趋势下降，且与模型组比较差异有显著性(P<0.01)(图2)。

图2 各组对CCl4急性肝损伤小鼠血清ALT(A)，AST(B)活性的影响

2.3 复方对CCl4急性肝损伤小鼠肝组织中MDA、SOD及GSH水平的影响 模型组小鼠肝匀浆MDA含量高于对照组，而SOD、GSH活性低于对照组(P<0.01)，表明本次实验造模成功。葛根素组，姜黄素组、沙棘黄酮组和复方组小鼠肝匀浆MDA含量均低于模型组(葛根素、姜黄素、复方组P<0.01，沙棘黄酮组P<0.05)，复方组降低MDA含量的效果显著优于其他组；葛根素组，姜黄素组和复方组肝组织匀浆中SOD活性及GSH水平比模型组显著升高(姜黄素、复方组P<0.01，葛根素组P<0.05)；沙棘黄酮组SOD活性与模型组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，GSH水平较模型组显著升高(P<0.05)；复方组提高SOD活性和GSH含量的能力相对较高(图3)。

图3.各组对CCl4急性肝损伤小鼠肝脏MDA(A)，SOD(B)和GSH(C)活性的影响

2.4 复方对CCl4急性肝损伤小鼠肝组织中TG及TCHO含量的影响 与对照组相比，四氯化碳模型组小鼠肝脏中TG显著升高(P<0.01)，葛根素组，沙棘黄酮组和复方组均可显著降低四氯化碳所致急性肝损伤小鼠肝脏TG含量(P<0.05或P<0.01)。复方具有最显著的效果，各组TCHO含量无显著性差异(图4)。

图4 各组对CCl4急性肝损伤小鼠肝脏TG(A)和TCHO(B)含量的影响

2.5 CCl4急性肝损伤小鼠肝组织病理学 透射电镜扫描图显示空白对照组小鼠肝细胞细胞核完整，呈圆形，细胞中有少量脂滴；四氯化碳模型组小鼠肝细胞发生明显核固缩，脂滴增多，线粒体变性；单一材料处理组选取了单独作用护肝效果相对较好的姜黄素组，透射电镜图显示姜黄素组小鼠肝细胞有较明显的核固缩症状；复方组小鼠肝细胞脂滴明显增多，细胞核基本完整，形状不规则，显示肝细胞受到轻微损伤(图5)。

3 讨论

四氯化碳进入肝脏后经肝微粒体激活后产生了自由基，引起过氧化反应，使肝细胞受损，破坏膜结构，使脂质内ALT、AST进入血液，造成血清ALT、AST活性升高[9]；本研究中四氯化碳模型组小鼠血清ALT、AST含量较对照组显著升高，葛根素组、姜黄素组和复方组均可显著降低四氯化碳所致急性肝损伤小鼠血清ALT和AST，说明这几种物质能起到缓解肝损伤作用，同等含量下沙棘黄酮的护肝作用相对稍微弱些。同时扫描透射电镜结果显示四氯化碳模型组小鼠肝细胞出现核固缩，线粒体变性，脂滴增多，这些都是典型的受到损伤的肝脏细胞的特征；复方组透射电镜结果显示肝细胞损伤程度相对较轻，说明复方起到了一定的护肝作用。

氧化应激是通过活性氧(ROS)的产生和去除造成的一种不平衡的紊乱状态。一方面，活性氧作为氧化代谢的副产物，经常损伤细胞大分子，如DNA，脂类和蛋白质[10]。ROS的爆发能够造成脂质过氧化，表现为MDA水平的升高。在本研究中，四氯化碳显著增加了肝脏中MDA的含量，复方组明显抑制MDA的产生，比葛根素、姜黄素、沙棘黄酮单独作用效果显著提升，复方可减轻肝细胞过氧化损伤。在本研究中，四氯化碳显著降低了谷胱甘肽的含量，谷胱甘肽是参与细胞抗氧化防御的重要分子，还原型GSH通过清除一些过氧化物，与具有毒性的外来的亲电子物质相结合，从而维持细胞和细胞器结构的完整性[11]，同时也降低了抗氧化酶(SOD)的活性。复方组显示具有较强的抗氧化作用，提高了谷胱甘肽浓度，增加了SOD酶活性。研究结果显示，四氯化碳模型组与对照组相比，肝脏的TG值会显著增高，表明四氯化碳明显影响肝细胞脂肪代谢。而TCHO的含量并未出现显著差异，推测是因为影响2种物质代谢的原因不一样，提示肝脏脂质代谢出现紊乱，复方组与模型组比较显著降低TG含量，起到稳定脂质代谢作用。

复方组之所以护肝效果更好应该是多种组分之间相互协同作用的结果，中药抗氧化应激和肝纤维化的作用机制特点为多环节、多途径、多靶点，并涉及多种细胞因子及细胞内信号分子网络[12]。复方能更好的清除体内活性氧自由基，清楚炎症，阻止机体产生脂质过氧化反应，使得抗氧化酶SOD更好的发挥抗氧化作用。进而减少GSH的消耗，而且细胞内GSH合成增多可以明显抑制肝星状细胞(hepaticstellatecell，HSC)的活化。

综上所述，葛根素、姜黄素、沙棘黄酮组成的复方可以缓解四氯化碳引起的肝损伤，包括抑制脂质积累和氧化应激。几种有效成分物质其他的比例是否有更好的护肝作用和其他潜在机制和信号通路有待进一步研究。