5种石斛对四氯化碳致小鼠急性肝损伤的保护作用

王凯+眭丹娟+王长锁+杨丽+欧阳臻+陈乃富+韩邦兴+魏渊

[摘要] 該文旨在研究比较霍山石斛、铁皮石斛（霍山）、铁皮石斛（云南）、铜皮石斛和河南石斛等5种石斛对四氯化碳急性肝损伤的保护作用。实验将C57BL/6小鼠随机分为空白对照组、模型对照组、5种石斛高（7.5 g·kg^-1）和低（1.25 g·kg^-1）2个剂量组。各组连续给药2周，末次给药2 h后，除对照组腹腔注射橄榄油外，其余各组腹腔注射0.5%CCl4橄榄油溶液。16 h后，采集小鼠血清及肝组织，测定小鼠血清中ALT，AST的活性；并检测肝组织中SOD和MDA的水平；计算肝脏指数并观察肝组织病理学变化，荧光定量PCR技术检测肝组织中IL-1β，IL-6和TNF-α的mRNA 的表达水平。结果显示，与模型组相比，各石斛组均能降低小鼠血清指标ALT和AST水平，使肝组织中MDA含量下降，SOD活性升高，减轻CCl4对肝脏的病理损伤。此外，霍山石斛肝组织中IL-1β，IL-6和TNF-α的mRNA表达水平显著下调。结果表明，5种石斛对四氯化碳急性肝损伤具有保护作用。但不同产地石斛和不同种石斛的保肝效果有所不同，其中霍山石斛效果最为显著，其他几种石斛保肝效果依次为铁皮石斛（云南）、铁皮石斛（霍山）、河南石斛和铜皮石斛，这可能与不同基源品种石斛化学成分不同有关。

[关键词] 石斛； 保肝； 四氯化碳； 急性肝损伤

[Abstract] This study aims to investigate the protective effect of Dendrobium huoshanense， D.officinale（Huoshan）， D.officinale（Yunnan）， D.moniliforme and D. henanense on CCl4-induced hepatic damage in mice. C57BL/6 mice were randomly divided into control group， model group， high-dose（7.5 g·kg^-1） and low-dose （1.25 g·kg^-1） groups of the five Dendrobium. Each group was intragastrically administered with drugs for 2 weeks. The control group was intraperitoneally injected with Olive oil solution， while the other groups were intraperitoneally given 0.5%CCl4combined with Olive oil solution 2 h later after the last administration. Subsequently， ALT and AST activities in serum， SOD activities and MDA contents in liver tissues were determined in all groups 16 h later after administration. The liver index was calculated， and hepatic histopathological examination was performed. The mRNA expressions of IL-1β， IL-6 and TNF-α were analyzed by Real-time PCR. Compared with the CCl4 model group， the activities of ALT and AST in serum decreased significantly in the five different Dendrobium groups. Meanwhile， in liver tissues， the levels of MDA reduced obviously， while the SOD activities markedly increased. Furthermore， liver tissue damage induced by CCl4 was ameliorated according to the histopathological examination. IL-1β， IL-6 and TNF-α mRNA expressions in D.huoshanense-treated liver tissues were significantly decreased. In conclusion， the five different Dendrobium groups showed hepatoprotective effects on CCl4-induced acute liver injury in mice. However， there were differences among Dendrobium of different types and origins. The protect effect of D.huoshanense is the most obvious， and the order of the protective effect of the other Dendrobium from high to low is D.officinale（Yunnan）， D. officinale（Huoshan）， D.henanense and D.moniliforme. The differences between the different types of Dendrobium might be related to their chemical components.

[Key words] Dendrobium； liver protection； CCl4； acute liver injury

石斛为兰科多年生草本植物，作为一种中国传统的中药材，其用药历史悠久，具有益胃生津、滋阴清热的功效。现代药理学研究表明石斛具有抗肿瘤、抗氧化、抗肝损伤和降低血糖的作用，在防治白内障和提高免疫力方面也有很好的疗效[1-2]。石斛植物来源众多，主要分布在华东、西南及华南地区，其中近40种可被药用[3]。石斛中化学成分类型多样，除生物碱外，还有菲类、联苄类、芴酮类、倍半萜类、香豆素、多糖、甾体及挥发油等[4]，各类成分的化学结构各有不同，其药理作用也存在一定区别，主要表现在不同石斛具有各自的特殊药理作用，相同药理作用又存在药效高低的不同[5-7]。

已有文献报道霍山石斛和铁皮石斛对急性肝损伤具有保护作用[8]，但其他几种石斛的保肝作用尚未见报道。同时，不同种石斛所含化学成分类型不同，同种不同产地的石斛，其化学成分含量也有差异，它们对肝损伤的疗效是否相同尚不确定。故本实验采集了霍山、云南2种不同产地铁皮石斛，并选取霍山、铁皮、河南、铜皮4个不同种石斛，通过建立四氯化碳致小鼠急性肝损伤模型，对石斛抗肝损伤作用进行对比研究，并初步探讨其作用机制，为合理开发和利用石斛提供科学依据。

1 材料

1.1 动物 健康SPF级C57BL/6小鼠，雄性，8周大，体重（20±2） g，购买于江苏大学實验动物中心，动物许可证号SCXK（苏）2013-0011。在实验室适应性饲养1周后用于正式实验，12 h明暗交替照明，自由进食、饮水。

1.2 药品 霍山石斛Dendrobium huoshanense C. Z. Tang et S. J. Cheng、铁皮石斛D. officinale Kimura et Migo（霍山）、铁皮石斛D. officinale Kimura et Migo（云南）、铜皮石斛D. moniliforme（L.） Sw和河南石斛 D. henanense J. L. Lu et L. X. Gao5种石斛（鲜品）均由皖西学院韩邦兴副教授提供和鉴定。石斛榨汁液的制备：将新鲜的石斛去根洗净，剪段，准确称量10 g后，将剪好的片段倒入榨汁机中，分次适量加入100 mL蒸馏水榨汁，用200目滤布过滤，置4 ℃冰箱保存备用。

1.3 试剂 四氯化碳购买于国药集团化学试剂有限公司；谷丙转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；总RNA提取试剂盒（MM031）购自徐州溥博生物科技有限公司；逆转录试剂盒（Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit）购自美国赛默飞科技公司；荧光定量试剂盒（Fast Start Essential DNA Green Master）购自瑞士罗氏公司。

1.4 仪器 SpectraMax 190型酶标仪（美国MD公司）；Model754型紫外分光光度计（上海现科分光仪器有限公司）；SK-1快速混匀器（江苏中大仪器厂）；IKA T10B型磁力搅拌器（德国IKA公司）；Pic017台式离心机（美国赛默飞科技公司）；LC-96荧光定量PCR仪（瑞士罗氏公司）。

2 方法

2.1 分组与给药方法 将C57BL/6小鼠随机分为12组，每组10只，分别为空白对照组、模型组、霍山石斛低剂量组（含生药1.25 g·kg^-1，参照《中国药典》石斛用量）、霍山石斛高剂量组（含生药7.5 g·kg^-1）、铁皮石斛（霍山）低剂量组（含生药1.25 g·kg^-1）、铁皮石斛（霍山）高剂量组（含生药7.5 g·kg^-1）、铁皮石斛（云南）低剂量组（含生药1.25 g·kg^-1）、铁皮石斛（云南）高剂量组（含生药7.5 g·kg^-1）、铜皮石斛低剂量组（含生药1.25 g·kg^-1）、铜皮石斛高剂量组（含生药7.5 g·kg^-1）、河南石斛低剂量组（含生药1.25 g·kg^-1）、河南石斛高剂量组（含生药7.5 g·kg^-1）。各给药组连续灌胃给药2周，每天1次，正常组和模型组同时给予等量的生理盐水。末次给药2 h后，将模型组和各给药组一次性腹腔注射0.5% CCl4橄榄油溶液10 mL·kg^-1，对照组给予等量的橄榄油。禁食16 h后使用二氧化碳窒息法处死小鼠。心脏取血，并分离小鼠肝脏。

2.2 肝脏指数的计算 4 ℃生理盐水去除肝脏表面残血，滤纸吸干后称重，计算肝脏指数。肝脏指数=肝脏质量（g）/小鼠体重（g）×100%。

2.3 血清指标及肝组织中相关酶活力的测定 小鼠血样室温静置2 h后，3 500 r·min^-1离心10 min，取血清，按照试剂盒的说明分别测定小鼠血清中ALT和AST的含量。称取肝脏相同部位的肝组织，加入9倍的生理盐水制成10%肝匀浆，3 500 r·min^-1离心10 min，取上清，按试剂盒说明检测SOD的活力及MDA含量。

2.4 肝脏病理组织切片观察 取小鼠肝脏右叶组织，放入10%甲醛中浸泡固定，常规石蜡包埋、切片（片厚5 μm）、HE染色，由江苏大学附属医院病理科陈淼主任光学显微镜观察肝脏组织病理学变化。

2.5 荧光定量PCR检测小鼠肝脏组织中相关炎症因子的表达 按照试剂盒说明提取小鼠肝脏组织中总RNA，逆转录合成cDNA，以β-actin作为内参基因，进行荧光定量PCR。PCR引物由上海生工生物公司设计合成，TNF-α的上游引物为5′-CTTCCAGAACTCCAGGCGGT-3′，下游引物为5′-CACTTGGTGGTTTGCTACGACG-3′；IL-1β的上游引物为5′-CTCGTGCTGTCGGACCCAT-3′，下游引物为5′-CAGGCTTGTGCTCTGCTTGTGA-3′；IL-6的上游引物为5′-TTCCATCCAGTTGCCTTCTT-3′，下游引物为5′-CAGAATTGCCATTGCACAAC-3′；β-actin的上游引物为5′-TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC-3′，下游引物为5′-TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3′。实时荧光定量PCR条件为： 95 ℃预变性300 s；95 ℃变性15 s，61 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，重复40个循环。实验重复3次，mRNA的表达水平采用比较阈值法进行分析，目的基因扩增的倍数值表示为2-ΔΔCt。

2.6 数据分析 实验数据采用SPSS 13.0软件进行单因素方差分析（One-way ANOVA） ，实验数据以±s表示，P<0.05表示有显著性差异。

3 结果

3.1 5种石斛对CCl4肝损伤小鼠肝脏指数的影响 与对照组相比，模型组肝脏指数有显著性升高（P<0.01）。5种不同石斛給药高剂量组与模型组相比肝指数均有所下降，其中霍山石斛、铁皮石斛（霍山）和铁皮石斛 （云南）有显著性降低（P<0.05），见表1。

3.2 5种石斛对CCl4肝损伤小鼠血清ALT，AST活性的影响 与对照组相比，模型组小鼠血清中ALT和AST活力显著升高（P<0.01），说明本次实验模型造模成功。与CCl4模型组比较，各石斛高低剂量组均能降低小鼠血清中ALT和AST的活性，其中铁皮石斛（云南）和铁皮石斛（霍山）高剂量组均有显著差异（P<0.05），而霍山石斛降低效果最为显著（P<0.01），见表1。

3.3 5种石斛对CCl4肝损伤小鼠肝脏组织形态的影响 对照组的肝组织形态结构正常，排列整齐，分界清楚，肝细胞无坏死现象；而模型组细胞结构紊乱，细胞核消失，肝细胞大量坏死以及炎症细胞浸润；而各石斛给药组小鼠肝组织病理学形态均有不同程度的改变，病理损伤减轻，细胞排列整齐，肝脏坏死和炎症细胞浸润均有不同程度的减轻，见图1。

3.4 5种石斛对CCl4肝损伤小鼠肝组织SOD活性及MDA含量的影响 与对照组相比，模型组小鼠肝组织中SOD的活力显著性降低（P<0.01），MDA含量显著性升高（P<0.01）。与模型组比较，5种石斛给药组均能够升高SOD的含量，并且能够抑制MDA含量的升高。其中，铁皮石斛（云南）和铁皮石斛（霍山）高剂量组均有显著差异（P<0.05），霍山石斛的效果最为显著（P<0.01），见表2。

3.5 霍山石斛对小鼠肝组织中炎症相关因子水平的影响 前期实验显示霍山石斛的保肝效果最为显著，而炎症反应在CCl4肝脏损伤过程中发挥重要作用，故选取霍山石斛研究石斛的保肝机制是否与炎症有关。与对照组相比，模型组肝脏组织中炎症因子IL-1β，IL-6和TNF-α mRNA水平显著升高（P<0.01），而霍山石斛给药组的小鼠抑制了肝组织中IL-1β，IL-6和TNF-α mRNA的过表达，差异具有统计学意义（P<0.01），且不同剂量下，mRNA表达水平均降低。这些结果表明，霍山石斛可以通过增加抗炎活性来预防肝损伤，见图2。

4 讨论

为研究石斛的保肝作用，本实验采用CCl4肝损伤模型，该模型目前是研究急性肝损伤的典型模型，重复性好，是研究保肝药物的常用模型之一。在CCl4肝损伤模型中，CCl4在肝微粒体细胞色素P450激活下生成三氯甲基自由基，这些自由基可与肝细胞内大分子发生共价结合，也可攻击膜不饱和脂质，引起脂质过氧化，使肝细胞损伤，转氨酶从受损的肝细胞内溢出，使血清中转氨酶升高[9-10]，所以通过测定血清中ALT，AST的含量，可以判断肝脏的损伤程度。本实验过程中，模型组注射0.5%CCl4后，与正常组比较，血清中ALT和AST含量显著升高（P<0.01），说明小鼠肝细胞受损，造模成功。与模型组比较，各石斛给药剂量组均能够降低小鼠血清中的ALT和AST含量，其中铁皮石斛（云南） 和铁皮石斛（霍山）高剂量（7.5 g·kg^-1）组有显著差异（P<0.05），而霍山石斛降低效果最为显著（P<0.01）。

SOD是生物机体内重要的抗氧化酶，其活力的高低反映了机体清除氧自由基的能力，而MDA是脂质过氧化反应的终产物，MDA含量的高低间接反映了机体细胞受自由基攻击时组织的过氧化损伤程度[11]。因此，测定肝匀浆中SOD和MDA的含量可反应肝细胞的受损伤情况。本实验结果显示，CCl4模型组小鼠比正常对照组小鼠肝组织SOD活性显著降低，MDA含量显著升高，说明肝细胞清除自由基的能力降低，细胞结构受损严重。而与CCl4模型组相比，5种石斛给药组均能不同程度的升高小鼠肝组织SOD活性，降低MDA含量，说明石斛可通过保护细胞膜，清除自由基，抑制脂质过氧化反应，从而降低肝细胞的损伤程度。

CCl4诱导活性氧类（ROS）的产生，ROS能够活化NLRP3炎性小体，并导致IL-1β，IL-6和TNF-α等炎症细胞因子的释放和表达，引发了炎症反应，从而加重肝脏损伤程度[12-13]。前期实验结果显示霍山石斛保肝效果最好，故选取霍山石斛研究石斛的保肝机制是否与炎症有关。实验结果显示，模型组小鼠肝组织病理切片中肝细胞大量坏死，充血以及炎症细胞浸润，荧光定量PCR结果显示模型组小鼠肝组织中IL-1β，IL-6和TNF-α炎症因子mRNA的表达水平显著高于对照组，这些结果表明CCl4显著诱导了小鼠的急性肝损伤，并引发炎症反应。而霍山石斛可显著抑制炎症因子IL-1β，IL-6和TNF-α的表达，减轻肝脏组织中的炎症症状，说明霍山石斛可通过抑制炎症通路发挥保肝作用。

有研究表明，迭鞘、马鞭、金铁、鼓槌、铁皮5种不同石斛对胃肠运动、对胃黏膜的保护、抗疲劳作用和增强免疫作用的药理作用各不相同[14-15]。本实验中霍山、铁皮、铜皮、河南4种石斛对CCl4急性肝损伤的保肝效果不尽相同，说明可能不同种石斛，由于其化学成分的不同，药理作用存在一定的差异。龚庆芳等研究发现广西、安徽、云南、浙江不同产地的铁皮石斛由于气候、土质等环境因素的差异，其多糖、甘露糖和毛兰素含量差异显著[16]。本实验选取云南和安徽2种不同產地铁皮石斛，发现其对CCl4急性肝损伤的保护效果有所不同，进一步说明可能由于不同产地石斛生长环境不同，化学成分含量之间存在差异，其药理疗效也有所区别。

霍山石斛是安徽道地药材之一，其用药历史悠久具有良好的药用价值。药理研究发现，霍山石斛中含有大量的中性多糖（DHP1）可能是其潜在的保肝成分，它的保肝活性可能与其结构有着密切的关系[17]。本实验结果表明，与其他几种石斛相比，道地药材霍山石斛显示出较好的保肝效果，实验结果进一步证明道地药材霍山石斛可能由于其特殊的结构和化学成分，具有独特的药理价值。

综上所述，本实验研究的5种石斛对四氯化碳肝损伤均具有保护作用，其作用机制可能与抑制脂质过氧化和炎症因子过表达相关。此外，本实验结果显示不同种石斛和不同产地石斛的保肝效果有差异，这可能是由于不同石斛化学成分和结构之间存在差异，其保肝的作用效果也不尽相同，到底何种成分起着重要作用，仍有待进一步的研究。

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[责任编辑 张宁宁]