外泌体在肿瘤中的作用及靶向治疗的研究进展

杨丽娟, 张加苗, 张 晶, 陈小平

(南通大学第四附属医院/江苏省盐城市第一人民医院 妇产科, 江苏 盐城, 224000)

肿瘤是由各种内外致瘤因素长期协同作用下引起的细胞基因水平突变和功能调控异常，导致细胞过度增生，从而形成具有异常结构和功能的新生物。肿瘤的特点包括无限增殖、浸润性和转移性，早预防、早诊断和早治疗是关键。目前临床上肿瘤生物的标志物主要为血清中蛋白类分子，其特异性和敏感性均欠佳[1], 所以寻找新的诊断标志物和治疗靶点十分重要。本文将外泌体作为标志物在肿瘤中的作用及其靶向治疗药物的研究进展予以综述，现报告如下。

1 外泌体

无论是正常细胞还是病态细胞，在细胞生长发育过程中都会不断地向外界环境释放充满液体的囊泡，通常称之为“细胞外囊泡”(EV)。其最初被认为是细胞碎片，但近年来细胞外囊泡被认为是细胞之间通讯、疾病诊断和疾病预后循环生物标志物的重要载体，具有巨大的临床应用潜力。根据直径的不同，其可分为4个亚群: 外泌体、微囊泡、凋亡小体和癌小体。其中外泌体是最重要的一种细胞外囊泡, 1983年研究者[2]在用抗转铁蛋白受体抗体标记绵羊网织红细胞孵育期间，在体外培养细胞的培养基上清液中发现, 1987年JOHNSTONE R M等[3]将这些囊泡命名为外泌体。外泌体直径为30～150 nm, 密度为1.13～1.19 g/mL, 用透视电子显微镜标准负染色方法可以观察到外泌体具有脂质双层，典型的盘样圆形囊泡，具有特征性杯形[4]。外泌体可以由多种哺乳动物细胞类型分泌，包括B细胞和T细胞，树突状细胞，间充质干细胞，上皮细胞，星形胶质细胞，内皮细胞和癌细胞。外泌体还被发现广泛存在于细胞培养上清以及各种体液中，包括血液、唾液、淋巴液、尿液、脑脊液、精液、乳汁、羊水、汗液及月经血等[5]。而且癌细胞比正常细胞分泌更多的外泌体[6], 这提示了外泌体可以作为肿瘤的生物标志物及靶向治疗的目标。

2 外泌体与肿瘤的关系

2.1 外泌体促进肿瘤的发生和增长

现有研究表明外泌体参与肿瘤的形成和发展。首先，外泌体蛋白可以通过自分泌途径改变细胞自身的命运，从而导致肿瘤的发生。RAIMONDO S等[7]在研究慢性髓系白血病的过程中发现，来自慢性髓系白血病细胞的外泌体中的细胞因子TGF-β1与白血病细胞上的TGF-β1受体相互作用，通过升高抗凋亡因子的表达水平、降低促凋亡因子的表达水平和激活细胞中的细胞外调节蛋白激酶(ERK)和蛋白激酶B(AKT)通路来促进肿瘤生长。在最近的一项卵巢癌研究[8]中，明确地证明了外泌体作为人类脂肪间充质干细胞(hAMSC)衍生的条件培养基(CM)(hAMSC-CM)的重要生物成分，能够抑制A2780和SKOV-3癌细胞的增殖、伤口修复和集落形成能力。同样，乳腺癌来源的外泌体处理后可以诱导肿瘤促进因子SDF-1、血管内皮生长因子(VEGF)、趋化因子(CCL5)和TGFβ的表达增加，通过SMAD介导的信号通路促进肿瘤细胞的进展[9]。其次，外泌体DNA改变细胞生存本身。外泌体是否携带DNA一直存在争议，因为外泌体来自于细胞质中的多囊体，与细胞核不相连。然而，一些研究小组已经在外泌体中发现了双链DNA片段和DNA突变。KAHLERT C等[10]发现在胰腺癌细胞和胰腺导管腺癌患者血清的外泌体中除包含线粒体和少量单链DNA外，还包含了大片段(>10 kb)的双链基因组DNA。同年，另一个研究组THAKUR B K等[11]在多种癌细胞系中，包括黑色素瘤、乳腺癌、肺癌、前列腺癌和胰腺癌，均检测到了双链DNA，且外泌体DNA代表了整个基因组，这和前面研究结论相同。TAKAHASHI A等[12]用透射电子显微镜对双链DNA进行免疫金标记，发现外泌体中存在DNA, 抑制外泌体的分泌后，导致细胞核DNA在细胞质中积累，从而激活活性氧依赖的DNA损伤反应导致细胞周期阻滞或凋亡，破坏了细胞的稳定性，导致细胞异常。

2.2 外泌体促进肿瘤的侵袭和转移

肿瘤转移是指恶性肿瘤细胞从原发部位，经淋巴道、血管或体腔等途径，到达其他部位继续生长的这一过程，是肿瘤治疗失败的主要原因。研究表明外泌体对肿瘤转移有着重要的影响，其相关机制主要有以下4种。第一，外泌体控制肿瘤细胞的极性和运动的方向。2012年, LUGA V等[13]研究报告了癌相关成纤维细胞分泌的CD81阳性的外泌体，通过激活自分泌的WNT/PCP信号通路，促进乳腺癌细胞的前伸活性、运动和转移。第二，来自肿瘤细胞的外泌体可以通过调节细胞外基质，促进细胞的侵袭和转移。例如，来自大鼠胰腺腺癌细胞系(ASML)的四跨膜蛋白中的CD151/和Tspan8阳性的外泌体，通过调节宿主细胞基质重组，影响造血细胞和基质细胞的活化，包括淋巴管和血管生成[14]。第三，外泌体可以解除紧密连接，增强肿瘤细胞的内渗。研究[15]发现，在转移性乳腺癌细胞中特征性表达和分泌miR-105外泌体，通过靶向紧密连接蛋白ZO-1，有效地破坏了内皮单层细胞的紧密连接和这些天然屏障的完整性，促进转移。第四，来自癌细胞的外泌体可以促进受体细胞的上皮-间充质转化(EMT), 促进肿瘤的侵袭和转移。最新研究表明，来自转移性结直肠癌细胞系SW620的外泌体miR-335-5p通过靶向RAS p21蛋白激活因子1(RASA1)促进EMT, 促进结直肠癌细胞的侵袭和转移。在宫颈癌的研究中发现，癌细胞源性外泌体miR-663b在暴露于TGF-β1后，被邻近或远处的宫颈癌细胞内吞，抑制甘露糖苷乙酰氨基葡萄糖苷转移酶3(MGAT3)的表达，从而加速EMT过程，促进癌细胞的局部和远处转移[16-17]。

2.3 外泌体促进了肿瘤的血管生成

肿瘤的血管生成是肿瘤生长、侵袭、转移的基本条件。肿瘤来源的外泌体含有四次跨膜Tspan8, 能有效地诱导肿瘤的血管生成。内皮细胞摄取含有Tspan8-CD49d复合物的外泌体后，通过上调血管生成相关基因，增强内皮细胞增殖和血管生成[18]。癌细胞来源的含Notch配体DLL4的外泌体，在体外通过抑制Notch信号增加了血管分支和血管密度，在体内，增加了血管分支、血管长度和血管大小[19]。血管内皮生长因子(VEGF)是最有效的促血管生成蛋白，可诱导内皮细胞增殖、发芽和血管形成。研究[20]发现，来源于卵巢上皮癌细胞系OVACAR-3的外泌体可增加内皮细胞的增殖和迁移率，还对VEGF的表达和分泌有促进作用。此外，赖氨酸氧化酶样4 (LOXL4)已被发现在多种人类恶性肿瘤中发生失调，最近有研究LOXL4在肝细胞癌(HCC)进展中的作用，发现HCC衍生的外泌体在HCC细胞之间转移LOXL4, 而LOXL4通过过氧化氢介导的机制激活FAK/Src通路，促进细胞迁移。此外, HCC衍生的外泌体通过旁分泌机制将LOXL4转移到人脐静脉内皮细胞中，以促进血管生成[21]。

2.4 外泌体促进了肿瘤的耐药

外泌体对肿瘤耐药具有强大的影响，并可以通过多种机制诱导肿瘤耐药。正如在卵巢癌中所观察到的，与对照组相比，外源表达SMAD4突变的A2780细胞在卡铂处理后, EMT标记物的上调，对卡铂的耐药性增加，释放外泌体使A2780受体细胞的耐药性增加了1.7倍[22]。同样，顺铂(DDP)耐药的肺癌细胞分泌的外泌体中miR-100-5p显著降低，可能通过调控mTOR信号通路使其他肺癌细胞对DDP产生耐药性[23]。另外，药物敏感细胞通过吸收来自耐药细胞的外泌体而产生耐药性。研究[24]发现，将阿霉素敏感的受体细胞暴露于含GSTP1的外泌体中，可以诱导敏感细胞达到耐药表型，并且GSTP1-siRNA处理的阿霉素耐药细胞凋亡率较高，对阿霉素耐药率较低。此外，肿瘤微环境中的外泌体也可诱导癌细胞产生耐药性。例如, 2018年, BINENBAUM Y等[25]发现巨噬细胞源性的外泌体在体内和体外均显著降低了胰腺癌细胞对吉西他滨的敏感性。最近，GAO Y等[26]通过单细胞RNA测序发现了一个新的癌症相关成纤维细胞(CAF)亚群CD63+ CAFs, 可以分泌富含miR-22的外泌体, miR-22结合其靶目标ERα和磷酸酶与张力蛋白同源物(PTEN), 使ERα和PTEN表达下调，从而促进乳腺癌细胞他莫昔芬耐药性。

3 外泌体作为肿瘤诊断和预后的生物标志物

外泌体在肿瘤中异常表达，有作为肿瘤特异性标记物的潜力。不仅如此，外泌体中含有多种蛋白质、核苷酸、脂质等分子，其特殊的双分子层脂质结构可以使其内的分子不容易被降解，而且外泌体可以在血液、尿液、唾液和脑脊液等体液中检测到，因此，外泌体是肿瘤诊断和预后标志物的一个理想选择。

3.1 微小核糖核酸(miRNA)

研究发现，miRNA在细胞分化、增殖、死亡和成熟等细胞过程的调控中起重要作用[27]。近年来，许多研究发现肿瘤细胞可以分泌外泌体，并认为外泌体中的miRNA可能是一种有效的生物标志物。例如，检测了血清miRNA在胰腺癌患者、导管内乳头状黏液性肿瘤(IPMN)患者和非肿瘤患者血清外泌体中的表达水平，发现血清外泌体中的miR-191、miR-21和miR-451a在胰腺癌患者和IPMN患者中的表达显著高于非肿瘤患者，提示3种血清外泌体中的miRNA的水平可作为胰腺癌和IPMN的早期诊断和进展标记物[28]。同样，通过分析原代结肠癌细胞系SW480和高转移性细胞系SW620分泌的外泌体miRNA的表达谱，发现从SW620培养上清纯化的外泌体中有25个miRNAs上调, 5个miRNAs下调，而且循环外泌体miR-17-5p和miR-92a-3p的高表达水平与结肠癌患者的病理分期和分级显著相关，提示外泌体miR-17-5p和miR-92a-3p可以作为监测结肠癌患者的预后标志物[29]。在卵巢癌的研究中发现，与健康女性相比，卵巢癌患者血浆外泌体中的miR-21、miR-100、miR-200b和miR-320显著富集，此外，外泌体miR-200b水平与肿瘤标志物CA125和患者总生存率相关，并影响着细胞增殖和凋亡[30], 提示外泌体中的miRNA可以作为卵巢癌患者诊断和预后的生物标志物。同样，小非编码RNA miR-128-3p的异常表达已被证明是肿瘤发生和癌症发展的关键调控因子，转染miR-128-3p的人正常结直肠黏膜(FHC)细胞有效地将miR-128-3p包装成分泌的外泌体，提高体外和体内CRC细胞中奥沙利铂的应答; 通过上调了E-cadherin水平，来抑制奥沙利铂诱导的EMT; 也通过抑制药物转运体MRP5的表达来减少奥沙利铂的外排，提示miR-128-3p在奥沙利铂化疗耐药过程中可能是一个有效的诊断和预后标志物[31]。

3.2 蛋白

外泌体携带一个具有调节受体细胞各种功能特性的效应蛋白组。在2014年发表的一项研究中，使用基于质谱的蛋白质组学对从4个上皮性卵巢癌细胞系(OVCAR3, OVCAR433, OVCAR5, SKOV3)来源的外泌体进行了分析，将其与公共数据库(Exocarta)和最新发表的NCI 60蛋白质组进行系统比较，发现富集了丰富的与信号生物学和生物标志物发现相关的蛋白质组类别[32]。同样, LIANG B等[33]检测了2种来自卵巢癌细胞系(OVCAR-3和IGROV1)的高纯度外泌体的蛋白谱，发现从2个卵巢癌细胞系中鉴定了2 230个外泌体蛋白，其中，同时存在于2个外泌体中有1 017个蛋白，包括所有主要的外泌体蛋白标志物，其中ExoCarta数据库中未报道的蛋白有380个。这些研究结果表明，卵巢癌来源的外泌体也携带与肿瘤发生和转移相关的组织特异性蛋白，可能在卵巢癌进展中发挥重要作用，并为血液蛋白质生物标志物提供了一个潜在的来源。TRIM家族是一类具有E3泛素连接酶活性的蛋白, TRIM3是TRIM家族成员之一，目前主要认为TRIM3是一种候选肿瘤抑制基因，可以抑制肿瘤细胞生长、侵袭与转移，与肿瘤的临床分期及预后关系密切。研究[34]发现，外泌体介导的TRIM3蛋白递送可抑制胃癌的体内外生长和转移，提示外泌体TRIM3可能作为胃癌诊断的生物标志物。

3.3 环状RNA(circRNA)

circRNA是一类具有闭合环状结构的非编码RNA分子，没有5′, 帽子结构和3′, poly结构，主要位于细胞质或储存于外泌体中，不受RNA外切酶影响，表达更稳定且不易降解，在多种真核生物内广泛存在[35]。复旦大学肿瘤医院肿瘤研究所的何祥火教授通过对外泌体的环状RNA进行测序，首次证明了外泌体中存在大量circRNA, 将外泌体、circRNA与肿瘤成功联系到一起，开创性提出了外泌体的circRNA可以作为肿瘤诊断的生物标志物的结论，为肿瘤诊断提供了新的发展方向[36]。最近，研究[37]检测了正常卵巢和卵巢癌组织中circRNA的表达水平，发现外泌体circWHSC1可转移到腹膜间皮细胞，促进腹膜播散，诱导肿瘤转移。最近，来自南京医科大学第一附属医院束永前课题组的研究发现，胃癌患者手术治疗后外泌体circSHKBP1水平显著降低，上调circSHKBP1的外泌体促进共培养细胞的生长。进一步研究其机制, circSHKBP1海绵化miR-582-3p增加HUR的表达，增强VEGF mRNA的稳定性，增强血管生成，诱导肿瘤发展[38]。

4 外泌体的临床应用

4.1 靶向治疗

靶向杀灭肿瘤细胞是一个精准而高效的治疗方法，医学研究就是为了找出肿瘤的特异性靶点，实现精准治疗，减少治疗过程对正常细胞的毒副作用。外泌体是一种天然的纳米生物载体，具有稳定性、膜渗透性，甚至可以穿过血脑屏障。因为外泌体“识别”特定的细胞，通过外泌体传递治疗药物比其他生物载体，如脂质体，有更好的疗效和更少的脱靶效应。因此，外泌体可有效运输和转移，如药物、miRNA、小干扰RNA (siRNA)、短发夹的传递和转移RNA (shRNAs)和其他在外泌体中保持稳定的化合物工具，用于治疗癌症和其他疾病[39]。一些提高外泌体肿瘤细胞靶向特异性和被肿瘤吸收的策略已被报道，例如卵泡刺激素受体-β(FSHβ)在人体中的分布比较有限，多集中于生殖系统，在其他器官组织中几乎未见分布，大多数卵巢癌组织表达FSHβ, 且表达水平高于正常的卵巢组织，是比较理想的卵巢癌肿瘤治疗的靶目标。岳艳等[40]通过基因重组技术，将FSHβ修饰到人胚胎肾细胞293(HEK293)细胞的外泌体上，通过其表面的特异性表达分子(ICAM-1、CA86、HLA-DR)诱导外周血T淋巴细胞的增殖作用，从而激发起抗肿瘤效应，其中负载Ex/FSHβ的树突状细胞能够诱导细胞毒性T细胞对卵巢癌细胞产生较强的诱导杀伤作用，为临床以外泌体为基础的肿瘤免疫治疗提供了一定的理论基础。2017年，根据来自美国德克萨斯大学安德森癌症中心的Kalluri团队的研究，对外泌体进行基因操控可能提供了一种新的胰腺癌治疗方法。KRAS的突变是胰腺癌的关键驱动因素，他们从人成纤维细胞培养的上清液中纯化了CD47+外泌体，然后引入靶向癌基因KRASG12D的siRNA或短发夹RNA (shRNA), 这种外泌体被称为iExosomes。iExosomes能够靶向KRASG12D基因，并且CD47对其有增强作用，在多个胰腺癌小鼠模型中，用iExosomes治疗可以抑制肿瘤的生长和转移，并显著提高总生存率[41]。除此之外，外泌体可以与传统的病毒载体结合使用，形成一种功能更强的基因治疗工具，例如利用外泌体包裹腺相关病毒载体可用于特异性转染神经元和少突胶质细胞，可能成为目前没有有效治疗方法的神经系统疾病，如多发性硬化症(MS)、脊髓性肌肉萎缩(SMA)或肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)的基因治疗的首选工具[42]。

4.2 抗癌疫苗

外泌体可以传递或呈现肿瘤来源的抗原，激活细胞毒性T细胞，比如树突状细胞(DC)衍生的外泌体疫苗。DC来源的外泌体表达MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ分子并可以诱导抗肿瘤免疫，与DC疫苗被抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞快速淘汰相比, DC来源的外泌体疫苗寿命相对较长，因此被认为是DC疫苗的替代品。DC衍生的外泌体疫苗已经在几个Ⅰ期临床试验中进行了测试。例如，2005年有研究团队检测了载有MAGE肿瘤抗原的自体树突状细胞衍生外泌体(DEX)在非小细胞肺癌(NSCLC)患者中的安全性、可行性和有效性, DEX治疗在晚期NSCLC患者中耐受性良好[43]。后来，在另一项Ⅰ期临床试验中，结肠癌患者腹水源性外泌体(Aex)作为疫苗注射到患者体内，经粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)处理后，产生了肿瘤特异性抗肿瘤细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应，说明Aex联合GM-CSF的免疫治疗是可行和安全的[44]。

综上所述，近几十年来对外泌体的研究，探讨了外泌体在不同生理和病理条件下的功能，基于细胞培养实验或实验模型，大量证据支持外泌体在肿瘤治疗中的应用。尽管只有少数外泌体用于癌症治疗的临床试验正在进行中，但外泌体作为肿瘤治疗的新平台和肿瘤生物标志物的应用是有希望的，这就需要未来对外泌体作用机制进行深入了解，将有助于外泌体在临床上的应用，使患者受益。