2种不同弹力纤维染色方法对肿瘤侵犯判读结果的对比研究

刘文超, 田 禾, 程 娜, 薛丽燕, 冯小龙, 郑 波

(中国医学科学院北京协和医学院国家癌症中心/国家癌症临床研究中心/北京肿瘤医院1. 病理科, 2. 胸外科, 北京, 100021)

目前，肺癌在所有恶性肿瘤中死亡率最高[1-2]。病理诊断医师在苏木精-伊红(HE)染色中不易判断肿瘤细胞是否侵犯脏层胸膜时，需加行弹力纤维染色。根据美国国立综合癌症网络(NCCN)指南TNM分期标准，即使肿瘤直径≤3 cm, 只要侵犯脏层胸膜，应归为T2期，而非T1期，故弹力纤维染色对肺癌患者的准确临床分期具有重要意义。胸膜侵犯程度与肺癌肿瘤 TNM 分期具有良好的相关性，是影响肺癌患者术后预后的重要危险因素[3]。由于不健康的生活方式和遗传背景，年轻人结直肠癌(CRC)的发病率逐年上升[4]。弹力纤维染色可有效提高结直肠癌脏层腹膜弹力层侵犯(VPELI)和血管侵犯(VI)的检出率。VPELI阳性肿瘤患者提示预后不良[5]。癌症的发病率逐渐升高，正确判断肿瘤是否侵犯及侵犯程度尤为重要。在临床病理工作中存在多种效果各异的弹力纤维染色方法，但对不同方法之间差异的研究较少。本研究通过对Victoria blue 法和Verhoeff法这2种染色方法的染色过程、染色时间、染色效果及对肺癌胸膜、结直肠癌浆膜或静脉侵犯判读难易进行对比，找到了一种操作简单、染色稳定、容易判读的弹力纤维染色方法。

1 材料与方法

1.1 材料

选取2017年9—12月怀疑侵犯的肺癌标本50例、结直肠标本20例为研究对象。每例病例切2张白片，分别入组Victoria blue 法(A组)和Verhoeff法(B组)。所有病例均经10%的中性福尔马林固定液固定后石蜡包埋切片。

1.2 试剂

1.2.1 A组所用试剂: ①维多利亚蓝染色液[6]。维多利亚蓝2.0 g, 糊精0.5g,间苯二酚4.0 g, 蒸馏水200.0 mL。将上述物质混合后加热煮沸，边煮边搅拌，约5 min。然后用另一容器取30.0%的三氯化铁水溶液25.0 mL, 另行加热煮沸后慢慢倒入上述混合液中，继续煮沸3 min, 不断搅拌溶液呈胶体状。去火冷却过滤，将滤纸上的残渣连同滤纸一同放在60 ℃的恒温箱中烤干。残渣呈深蓝色细颗粒状粉末，再将其溶于400.0 mL的70.0%乙醇液中，然后加浓盐酸4.0 mL和苯酚5.0 g, 放置至成熟后使用。② 核固红染色液。核固红0.1 g, 硫酸铝5.0 g, 蒸馏水100.0 mL, 麝香草酚50.0 mg。先将硫酸铝溶于蒸馏水，然后加入核固红，稍微加温溶解，冷却后过滤，加入麝香草酚。

1.2.2 B组所用试剂: ① 铁碘苏木素溶液(弹性纤维染色液-Ⅰ)。苏木素2.8%, 三氯化铁5.0%, Verhoeff氏碘液(碘化钾2.0 g、典结晶1.0 g、实验室三级水100.0 mL), 无水乙醇。② 三氯化铁溶液(弹性纤维染色液-Ⅱ)。三氯化铁2.0%, 实验室三级水。VG染色液(弹性纤维染色液-Ⅲ)。酸性复红液1.5%, 桔黄G 0.5%, 实验室三级水。

1.3 染色方法

1.3.1 弹力纤维染色: 2位技师对入组标本随机平均分配(每位技师25例肺癌及10例结直肠癌)，进行A组和B组弹力纤维染色。染色方法如下: ⑴ A组。① 石蜡切片，脱蜡入水。② 切片入70.0 %乙醇1 min。③ 切片浸入Victoria blue 染液中1.5 h。④ 用95.0%乙醇分化2～3 s, 水洗。⑤ 切片浸入核固红染液8～15 min, 水洗。⑥ 用95.0%乙醇及无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。⑵ B组。① 切片脱蜡至水。② 铁碘苏木素染色15～30 min, 至颜色呈深黑色。自来水洗。③ 三氯化铁溶液分化10～20 s, 至弹力纤维清晰为止，自来水充分水洗。④ 入95.0%乙醇2～5 min, 自来水水洗2遍。⑤ 滴染VG染色液染色1～2 min。⑥ 用95.0%乙醇急速分化。无水乙醇脱水，二甲苯透明、中性树胶封固。

1.3.2 2种染色方法的比较: 对2种方法的染色过程、操作时间进行对比。染色判读及评分: 请2位病理医师盲法对所有特染切片染色效果、肿瘤侵犯判读难易程度进行评价，对胸膜、浆膜或静脉侵犯结果进行判读。评分标准: 从弹力纤维定位定性准确、染色背景干净、肿瘤细胞与弹力纤维对比清晰、炭末有无影响炭判读这4个方面进行判读评价，单项分数最高2分，最低0分，即弹力纤维定性定位不准确0分，较准确1分，准确2分; 染色背景不干净0分，较干净1分，干净2分; 肿瘤与弹力纤维对比不清晰0分，较清晰1分，清晰2分; 炭末有影响0分，较影响1分，无影响2分。4项内容满分共计8分。

1.4 统计学分析

评分汇总应用SPSS 22.0软件进行统计学分析。采用两配对样本的Wilcoxon非参数检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 2种染色方法染色步骤及染色时间比较

分化是染色程序的关键步骤, A组和B组分别耗时2～3 s和35 min。见表1。

表1 2种方法染色过程、操作时间对比

2.2 判读结果

2种方法的判读结果显示，A组分别有41.43%、58.57%的患者被判读为侵犯性和无侵犯性，所有患者均可通过Victoria blue法判读。B组分别有37.14%、61.34%的患者被判读为侵犯性和无侵犯性, 1例患者不能通过Verhoeff法判读。见表2。

表2 肺癌胸膜侵犯、结直肠癌浆膜或静脉侵犯判读结果比较[n(%)]

2.3 染色评分

A组各项评分均高于B组，且A组总分[(7.42±0.94)分]高于B组总分[(4.89±1.53)分]，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 弹力纤维染色评分 分

2.4 染色效果

A组分化易掌握，肿瘤细胞与弹力纤维对比清晰，炭末不影响判读，低倍镜下易判读。B组分化不易掌握，肿瘤细胞与弹力纤维对比不清晰，炭末影响判读，低倍镜下不易判读。见图1。

3 讨 论

目前公认脏层胸膜由以下 4层构成: 间皮细胞层; 间皮下结缔组织层; 弹力纤维层; 结缔组织层分隔弹力纤维和肺实质[7]。弹力纤维染色在肺癌病例中主要用于显示肿瘤细胞与胸膜的关系，从而评估肿瘤侵犯层次，对病理学指标的TNM分期有重要临床意义。在结直肠癌中，浆膜或静脉侵犯是评价临床术后病理分期(pTNM)及临床个体化治疗的重要指标[8-9]。

高效准确的病理报告对临床医生进行临床决策至关重要。在实际的临床工作中，病理医生的工作量大。操作简单、染色稳定、容易判读的弹力纤维染色方法对病理技术人员和病理医师具有重要意义。肺癌胸膜侵犯、结直肠癌浆膜或静脉侵犯判读结果(表2)表明，A组和B组相比，B组存在漏诊，导致漏诊病例的TNM分期不准确，进而对判断患者预后及后期个体化治疗造成影响。

B组存在漏诊的原因主要有以下几个方面: 首先, B组弹力纤维呈黑色，细胞核呈棕黑色、胶原纤维呈红色。细胞核和弹力纤维对比不明显，难以辨认二者之间的关系(图1b)。在低倍镜下，医生很难通过B组染色分辨肺癌胸膜是否侵犯、结直肠癌浆膜或静脉是否侵犯(图1b、2b)。而A组弹力纤维呈蓝色，细胞核呈红色。该法在染液中浸染1.5 h, 用核固红复染，红色的细胞核与蓝色的弹力纤维对比清晰，对较粗、较细的弹力纤维染色效果均显著[10], 能够清晰显示肿瘤细胞与弹力纤维的关系(图1a), 通过该法医生在低倍镜下能轻松、准确判读肺癌胸膜、结直肠癌浆膜或静脉是否侵犯(图1a、2a), 从而提高诊断工作效率。其次，在肺癌病例中, B组炭末、细胞核及弹力纤维均为黑色，黑色的炭末影响细胞核与弹力纤维关系的判读(图3b)。而A组弹力纤维呈蓝色，细胞核呈红色，黑色的炭末不影响细胞核与弹力纤维关系的判读(图3a), 细胞核与弹力纤维对比清晰(图4a、5a), 染色效果能够满足病理医生的诊断需求。再次，B组对三氯化铁分化步骤要求较高，需根据弹力纤维清晰程度决定分化时间，因此需要进行单张分化。根据实验结果(表1)，如同时染多张切片，染色技术员需付出较长时间进行该染色方法的分化工作，且容易出现分化不一致、染色结果不稳定的情况。当分化不够时，染色结果对比不清晰(图4b); 分化过度时，则不能较好地显示弹力纤维(图5b), 容易出现因分化不佳导致的重复染色，从而影响诊断。此外，该法染液不能长期保存和重复使用。而A组分化过程不用单张操作，分化时间短且一致，工作效率提高，降低了技术人员的工作难度，提高了染色稳定性。此外该法染液适宜浸染，配置结束后约0.5 h放置成熟即可使用，常温条件下可保存数年，使用方便。

1a: A组染色效果。肺癌,肿瘤细胞与弹力纤维对比清晰; 1b: B组染色效果。肺癌,肿瘤细胞与弹力纤维对比不清晰; 2a: A组染色效果。肠癌,低倍镜下易判读; 2b: B组染色效果。肠癌,低倍镜下不易判读; 3a: A组染色效果。肺癌,炭末不影响判读; 3b: B组染色效果。肺癌,炭末影响判读; 4a: A组染色效果。肺癌,分化易掌握,肿瘤细胞与弹力纤维对比清晰; 4b: B组染色效果。肺癌,分化不够,肿瘤细胞与弹力纤维对比不清晰; 5a: A组染色效果。肺癌,分化易掌握,肿瘤细胞与弹力纤维对比清晰; 5b: B组染色效果。肺癌,分化过度,肿瘤细胞与弹力纤维对比不清晰。图1 2种弹力纤维染色方法的染色效果(放大倍数10倍)

综上所述, Victoria blue法染色对肺癌脏层胸膜侵犯和结直肠癌浆膜或静脉侵犯结果的判读更清晰、准确，能很好地满足病理医生诊断的需要，具有染色质量稳定、对比清晰、炭末不影响判读、操作简单和安全可靠等诸多优点，能够为病理诊断提供更加可靠的依据，为肿瘤患者提供更高效的服务。