纳米雄黄的制备及其在肿瘤治疗中的应用现状*

李丽莉，苏 燕，马 强,3,4

(1.包头医学院血液保护研究所，内蒙古包头 014040；2.包头医学院基础医学与法医学院；3.南方科技大学医学院；4.南方科技大学医院)

雄黄是一种硫化砷类矿物药，具有悠久的用药历史，是中医临床常用药物。在现代医学中，雄黄主要用于血液系统恶性肿瘤的治疗，但由于其水溶性差，生物利用度低，临床使用剂量大，在一定程度上限制了雄黄在其他实体性肿瘤中的应用。随着纳米技术的发展，纳米化雄黄(以下简称纳米雄黄)有效提高了雄黄的水溶性及生物利用度。同时，其抗肿瘤药效相比原药进一步增强，表现出更强更广谱的抗肿瘤能力，有望在未来进一步拓展适用范围，在其他实体肿瘤治疗中发挥更广阔的作用。

1 雄黄在传统医学中的应用

雄黄是中医最早使用的矿物药物之一，辛、性温、有毒，归肝、大肠经，具有解毒杀虫、燥湿祛痰、截疟的功效，主要用于痈肿疔疮、虫蛇咬伤、虫积腹痛、惊痫、疟疾等证的治疗[1]。我国最早的药学专著《神农本草经》对雄黄即有收载：“雄黄，主寒热、鼠瘘恶疮、疽痔死肌、杀精物、恶鬼、邪气、百虫毒，胜五兵。”其后的历朝历代本草对雄黄均有收载。雄黄药效作用经过数千年临床应用得到了充分肯定，迄今依然作为安宫牛黄丸、牛黄解毒片和六神丸等临床常用成药的主要组方药物在中医临床中使用。在西方传统医学中也有雄黄作为药物的使用记载，早在古希腊时代，希波克拉底便记载了雄黄具有治疗溃疡的药效作用[2]。古罗马时代著名医学家盖伦推荐使用硫化砷膏治疗溃疡[2]。文艺复兴时期著名医学家、炼金师帕拉塞尔苏斯广泛研究了砷类化合物的性质和相互转化，并尝试使用雄黄治疗癌症[2]。

2 雄黄在现代医学中的应用及不足

现代医学中，雄黄主要用血液系统恶性肿瘤的治疗。刘学永等[3]将43例中高危骨髓增生异常综合征患者随机分为治疗组和对照组，治疗组给予雄黄，对照组给予小剂量CAG方案化疗，研究发现治疗组总有效率(90.9 %)明显高于对照组(71.5 %)。周庆兵等[4]通过病例资料分析发现，以青黄散加补脾益肾中药为主的综合治疗方案对骨髓增生异常综合征伴多系发育异常具有一定的临床疗效。目前，雄黄在我国已经作为一线化疗药物应用于急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)的治疗[5]。然而，由于雄黄晶格能较高、难溶于水而导致的生物利用度低下使其在临床应用中也面临一些障碍和限制。

3 纳米雄黄的制备及方法

雄黄是生物药剂学分类系统(Biopharmaceutics Classification System，BCS)Ⅱ类药物。对于这类难溶性药物，减小药物粒径至微米/纳米级，是提高药物溶解度和生物利用度的通行手段。当难溶性药物的粒径减小至1 μm以下时，其溶解度会随粒径减小而不断增加，特别是当药物粒径减小到200 nm以下时，这种“增溶”作用更加明显，其原理是通过降低药物扩散边界层厚度以提高溶出速度[6]。当前用于纳米雄黄制备的方法主要有物理法和化学合成法两大类。

3.1物理法 物理法制备纳米雄黄，制备工艺相对简单，可连续、大规模生产纳米雄黄。高能球磨法是常用的物理方法，该法利用球磨机的转动或振动，可以使硬球与原料产生强烈的撞击、研磨和搅拌作用，进而把样品粉碎为微米或纳米级粉体。王晓波等[7]通过温度可控惰性气氛高能球磨法制备纳米雄黄，通过调整球料比、球磨时间、球磨机转速、球磨介质比例、球磨温度等因素制备出了粒径小于100 nm的雄黄颗粒。气流粉碎法是利用高速气流或过热蒸汽的能量使颗粒互相冲击、碰撞和摩擦，从而使颗粒粉碎的粉体制备方法。谢长生等[8]利用气流粉碎技术，制备得到粒径在1～100 nm范围的纳米雄黄。詹秀琴等[9]通过气流粉碎、细珠研磨和微射流法制备微米/纳米雄黄，制备得到粒径在280 nm的雄黄颗粒。但由于纳米雄黄体积小，表面能大，因而极不稳定，极易重新聚合成为较大的颗粒。詹秀琴等[9]考察了羟甲基纤维素(Caboxy Methyl Cellulose，CMC)、聚乙烯比咯烷酮(Polyvinylpyrrolidone，PVP)、微晶纤维素、卵磷脂、吐温80和聚乙二醇对纳米雄黄颗粒水分散状态下稳定性的影响，发现CMC和PVP可以有效稳定水分散液中纳米雄黄。

但是剧毒副产物As2O3累积严重是物理制备方法的共性缺点，还需进一步优化制备过程和工艺。Zhao等[10]为解决制备产品中As2O3累积，采用球磨后对产物再次水洗、酸洗或碱洗的方式处理纳米雄黄，可以有效降低纳米雄黄中As2O3的含量。

3.2化学合成法 宁凝等[11]使用溶剂接力法，以二硫化碳、1,2-丙二醇和丙酮按特定比例混合后，在索氏提取器中连续回流溶解雄黄，然后将粗产物中的二硫化碳和丙酮蒸发，减压浓缩，得到平均粒径159.0 nm的纳米雄黄1,2-丙二醇混悬液。陈韵[12]利用雄黄不溶于水和稀酸，但溶于碱的性质，将雄黄用饱和硫化钠溶液溶解。作者考察了纳米雄黄在不同分散介质中的稳定性，发现纳米雄黄在0.1 %的PVP中会以约20 nm的颗粒形态存在；在0.5 %的淀粉溶液中会以约30 nm的颗粒形态存在；而在5～10 mol/L牛血清白蛋白中会以约10 nm的颗粒形态存在。王子妤等[13]采用薄膜分散-高压均质法制备纳米雄黄脂质体，制备得到的纳米雄黄脂质体药物包封率高(82.78 %)、颗粒分散性良好、粒径均匀(约100 nm)。化学合成法在制备过程会有一定的溶剂残留，制备过程还会有毒性物质如H2S的生成释放，同时由于实验条件、步骤相对复杂，较难用于纳米雄黄的规模化生产。

4 纳米雄黄在抗肿瘤研究中的应用

4.1纳米雄黄抗乳腺癌的作用研究 乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤。Xi等[14]在体外、体内水平评价了纳米雄黄抗乳腺癌的药效作用。在体外，纳米雄黄能抑制乳腺癌4T1细胞的迁移和侵袭相关基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase 2，MMP-2)和MMP-9的表达。纳米雄黄治疗乳腺癌模型小鼠32 d后，肺、肝转移较对照组明显减少，同时肿瘤组织中与侵袭性密切相关的MMP-2和MMP-9表达下调。李秀荣等[15]用不同浓度纳米雄黄处理乳腺癌MCF-7细胞，发现纳米雄黄可通过上调E-cad、下调HIF-1α，抑制Snail mRNA转录，逆转乳腺癌MCF-7细胞上皮间质转化，进而发挥抗乳腺癌侵袭和转移的作用。

4.2纳米雄黄抗白血病的作用研究 APL是急性髓系细胞白血病(acute myelocytic leukemia，AML)的M3亚型。Fang等[16]使用雄黄和(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechin-gallate，EGCG)制备了平均粒径为(200.30±1.23)nm的表没食子儿茶素没食子酸酯装载的纳米雄黄(Nano-realgar Encapsulated in EGCG，EGCG-RNPs)。EGCG-RNPs在体外可以显著抑制APL细胞系HL-60细胞的生长。通过HL-60细胞的吸收和外排实验证明，EGCG-RNPs增强雄黄其抗肿瘤作用机制可能与增加HL-60细胞对雄黄的摄取及延长雄黄在HL-60细胞中的滞留时间有关。

慢性髓细胞性白血病(chronic myeloid leukemia，CML)是22号染色体长臂上的Bcr基因易位到9号染色体长臂，与Abl基因融合形成Bcr-Abl融合基因。Bcr-Abl融合基因表达的BCR-ABL蛋白具有高酪氨酸激酶活性，进而导致了下游信号通路的改变，使细胞分化和凋亡受阻，从而引起CML发生[17]。研究表明，纳米雄黄可以通过诱导BCR-ABL蛋白泛素化降解抑制CML细胞增殖达到治疗CML的目的。Shi等[18]发现，纳米雄黄除可有效诱导BCR-ABL蛋白降解外，还具有抑制PI3K/Akt/mTOR通路，诱导细胞自噬，从而抑制CML细胞增殖，并促进CML细胞分化的作用。这其中小窝蛋白1(caveolin-1，Cav-1)可能介导了纳米雄黄内吞及诱导CML细胞凋亡和自噬的作用。研究表明，过表达Cav-1的细胞自噬相关蛋白LC3表达明显提高，同时细胞对纳米雄黄的敏感性也显著增强。

4.3纳米雄黄抗肺癌的作用研究 Tian等[19]发现，纳米雄黄对肺癌细胞系A549细胞具有显著的生长抑制作用，并且具有时间-剂量效应。王巍炜等[20]的研究表明，纳米雄黄可以有效诱导A549细胞凋亡，同时抑制其转移相关蛋白整合素β1(integrin β1)和上皮钙黏素(cadherin)的表达。王胜玫等[21]以聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone，PVP) K30为载体，通过生物模板法制备雄黄纳米粒，可抑制 A549细胞的增殖，通过降低细胞内固有的凋亡抑制蛋白IAP家族成员survivin的表达，有效诱导肺癌A549 细胞凋亡。李慧杰等[22]研究表明，纳米雄黄可抑制肺癌干细胞代谢重编程关键因子 HIF-1α mRNA 表达，并下调 C-myc mRNA，上调 p53 mRNA 表达，抑制相关蛋白 PI3K、Akt、mTOR、GLUT1、PDK1、PFK、PKM、PDH、LDH的表达，且具有剂量依赖效应。Yang等[23]也发现，纳米雄黄可抑制肺癌干细胞活力，促进糖代谢，并以时间和剂量依赖的方式抑制代谢重编程相关蛋白表达，其机制可能是下调HIF-1α和PI3K/Akt/mTOR通路的表达。

4.4纳米雄黄抗卵巢癌的作用研究 马淑云等[24]在卵巢癌细胞系COC1细胞上评价了纳米雄黄对卵巢癌的药效作用，发现纳米雄黄主要通过抑制Bcl-2蛋白表达、上调Bax和Caspase-3蛋白表达促进卵巢癌细胞凋亡发挥抗卵巢癌作用。秦艳等[25]使用SKOV3细胞验证了纳米雄黄抗卵巢癌的药效作用，作用机制也主要与降低Bcl-2/Bax比值，诱发细胞凋亡相关。目前发现，纳米雄黄主要是抑制了卵巢癌细胞的Bcl-2蛋白表达、上调Bax和Caspase-3蛋白表达发挥诱导卵巢癌细胞凋亡的药效作用。

综上所述，纳米雄黄在临床及基础研究中已展示出对某些类型的肿瘤具有一定的疗效。同时，由于与现行化疗药物没有交叉耐药，可与其他诸如细胞毒性化疗药、靶向药物或免疫类药物联合使用，在提高疗效的同时，可以延缓或抑制肿瘤耐药的发生。但目前对纳米雄黄的抗肿瘤作用机制和毒性评价仍不完善，需要继续深入研究，为进一步开发以纳米雄黄为基础的抗肿瘤药物奠定理论和实验基础。