MALDI-TOF MS在常规标本病原菌鉴定和细菌耐药性检测中的应用及进展*

张雅静 综述，李劭昱 审校

新疆医科大学附属肿瘤医院检验科,新疆乌鲁木齐 830011

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)主要利用质谱图中的特征峰对细菌进行鉴定和分类。MALDI-TOF MS由基质辅助激光解吸离子源和飞行时间质量探测器组成，即MALDI+TOF。其原理为标本与基质混合点于金属靶板上并出现结晶析出的现象，激光照射结晶后，基质获得能量发生汽化、降解并与标本吸附解离，基质和标本间进行电荷转移，标本分子获得质子成为离子，于电场之中，标本离子飞速运动、聚焦，最终进入飞行时间探测器，离子的质荷比和飞行时长的平方之比为常数，根据飞行时长能够探测到不同质荷比的离子，用最终获得的质谱图区分和鉴别不同微生物。目前，MALDI-TOF MS在微生物检验领域已取得较好的应用效果。CLARK等[1]提出，MALDI-TOF MS可以用于革兰阳性细菌(葡萄球菌、链球菌、肠球菌、乳球菌、芽孢杆菌、棒状杆菌、李斯特菌等)、革兰阴性细菌(肠杆菌等)，以及厌氧菌、分枝杆菌等多种细菌的鉴定。BLOSSER等[2]发现，MALDI-TOF MS可用于鉴定临床相关诺卡菌。SALI等[3]用MALDI-TOF MS检出了布鲁菌。LI等[4]也探讨了MALDI-TOF MS对于厌氧菌的快速检测。此外它也可以用于细菌分型、细菌毒力检测、微生物亚种水平鉴别以及耐药检测等。

1 MALDI-TOF MS鉴定常规标本中的病原菌

MALDI-TOF MS可对血培养、尿液、痰液等标本中的病原菌进行早期鉴定，便于临床及时救治细菌感染患者，使患者体内微生物恢复稳态。

1.1血培养阳性标本的鉴定 ALTUN等[5]用MALDI-TOF MS鉴定固体培养基短期培养后的血流感染病原菌，发现仅需2.5 h培养时长鉴定准确率便可达到58.3%，5.5 h后鉴定准确率能达82.3%，结果表明MALDI-TOF MS在鉴定血培养阳性方面较有优势，不需要很长的培养时间，从而节省了检测时间。KÖCK等[6]通过相同方法鉴定血培养阳性标本，与传统方法相比，所耗时长由15 h缩短到了3 h。ZHOU等[7]开发了一种“内部”(IH)方案，用MALDI-TOF MS直接进行血培养阳性标本中病原菌的鉴定，对于单菌种培养，有94.4%可以准确鉴定到种和属，其中厌氧菌的鉴定准确率达80%；对于多菌种培养，若采用标准模式，能够准确鉴定出血培养多种阳性菌株中的单一菌种，若采用混合法，52.9%的标本可被准确检出两种病原菌。FLORIO等[8]利用MALDI-TOF MS提出了一种快速鉴定多菌种血培养中病原菌的方法，即将病原菌先在液体培养基中进行短期的选择培养，然后用质谱进行鉴定，总鉴定准确率可达85.7%。在含有两种不同病原菌的血培养中，其鉴定准确率达100%；在含有两种以上病原菌的血培养中，其鉴定出两种病原菌的准确率达86%。相比于常规方法，链球菌及肠球菌的鉴定时长缩短到4.2 h，葡萄球菌的鉴定时长缩短到8.7 h，革兰阴性菌的鉴定时长缩短到11.1 h。WANG等[9]将标本前处理后用MALDI-TOF MS直接鉴定血培养阳性瓶，此过程可以控制在1 h内，并且总鉴定准确率达94.5%，其中革兰阴性菌、革兰阳性菌的鉴定准确率分别为96.9%、94.5%。可见MALDI-TOF MS大大解决了常规方法耗时长、工作效率低的问题，能够快速、准确地鉴定出血培养阳性标本中的病原菌。

1.2尿路感染标本的鉴定 HAIKO等[10]用U-si-MALDI-TOF(尿液短孵化MALDI-TOF)方法鉴定尿液中的病原菌，革兰阴性菌的鉴定准确率可达86%，其中大肠埃希菌的检测周转时间缩短到了4～6 h，为尿路感染标本的检测做出了很大贡献。LI等[11]发现将流式细胞仪筛查、MALDI-TOF MS及VITEK 2 Compact的鉴定和药敏分析相结合可以用于尿路感染的快速确诊，细菌的总检出率为86.42%，革兰阴性菌的检出率为88.59%，其中肠杆菌的鉴定准确率达94.83%，并且整个过程仅需7～9 h。ILKI等[12]同样将尿液经流式细胞仪进行菌量筛选后用MALDI-TOF MS进行病原菌鉴定，可检测出91.8%的菌株，革兰阴性菌的总鉴定准确率为95.8%，其中大肠埃希菌的鉴定准确率为90.0%，肺炎克雷伯菌的鉴定准确率为87.0%。SUN等[13]通过UF-5000i流式细胞仪筛选出尿路感染标本后用MALDI-TOF MS直接进行尿液病原菌的鉴定，鉴定准确率达94.7%，并且能将时间控制在1 h内。因此，用MALDI-TOF MS鉴定尿路感染标本时，不仅能够缩短标本周转时间(TAT)，而且能获得十分可靠的结果，其中对革兰阴性菌的鉴定尤为准确，使尿路感染患者及早得到救治。

1.3呼吸道感染标本的鉴定 MEDIAVILLA-GRADOLPH等[14]用MALDI-TOF Bruker鉴定呼吸道感染标本来源的分枝杆菌，其中非结核分枝杆菌(NTM)的鉴定准确率达98.4%。LPEZ-FABAL等[15]用MALDI-TOF MS Vitek检测呼吸道感染标本来源的分离株，检出了100%的卡他莫拉菌、86%的肺炎链球菌、79%的流感嗜血杆菌，该方法不仅鉴定准确率优于常规方法，而且能够正确定义存在争议的鉴定结果。FERNNDEZ-ESGUEVA等[16]利用MALDI-TOF MS(检测仪器是布鲁克·道尔顿公司的产品)直接鉴定MGIT液体培养基中的分枝杆菌，避免了琼脂平板培养的时间消耗，加快了检测进度，并且鉴定准确率达到98.06%，证明了该质谱可以用于诊断分枝杆菌导致的呼吸道感染。可见MALDI-TOF MS在呼吸道感染标本的鉴定方面比传统的常规方法更加省时并且准确率更高，更利于临床工作的开展。

2 MALDI-TOF MS检测细菌的耐药性

MALDI-TOF MS对细菌耐药性的检测大致可以归纳为不借助抗菌药物的直接检测和借助抗菌药物的间接检测。

2.1直接检测

2.1.1直接检测耐药菌的特征峰 耐药菌与敏感菌的质谱图存在着一定水平的差异，例如特征峰强度的改变(增高或降低)、峰的缺失或增加、峰值坐标空间位置的移动，据此创建的耐药菌菌谱库可以直接用于耐药菌的检测。

2.1.1.1耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的检测 胡燕燕等[17]实验得出区分MRSA和甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA)最主要的特征峰为3 279、6 485、6 555、3 299 m/z 处的峰，MRSA组3 299 m/z处的质谱峰高于MSSA组，而3 279、6 485、6 555 m/z处的质谱峰低于MSSA组。mecA基因可以介导细菌对甲氧西林耐药，其位于葡萄球菌盒染色体mec(SCCmec盒)上，所以MRSA基因组中的Ⅱ、Ⅲ、Ⅷ型SCCmec盒上可编码一种小肽(PSM-mec)，该小肽可被MALDI-TOF MS检测到。RHOADS等[18]用MALDI-TOF MS筛选MRSA时发现了2 415 m/z处的特征峰并利用反义RNA技术确定了该峰为PSM-mec，进而表明了MRSA的存在，虽然该峰并不是MRSA的特有峰，但从某种意义上说，这启发了一种新的检测思路。KIM等[19]基于MALDI-TOF MS并根据mecA和SCCmec分型，鉴定出了21个峰在MRSA和MSSA间有明显差异，并将特定的峰值进行组合，这些组合峰为MRSA的鉴定提供了更充分的依据。WANG等[20]在2 415、2 455、2 545、3 035、3 895、5 005、5 525、6 425、6 435、6 595 m/z左右的MRSA特征峰的基础上，又发现了一种现象，即在2 435 m/z附近MRSA的特征峰较MSSA多,在5 285、6 905 m/z附近MSSA的特征峰较MRSA多，MALDI-TOF MS基于这些特征峰的检测使得MRSA和MSSA更加便于区分。MALDI-TOF MS对于MRSA的检测，告别了常规方法的费时、费力，为未来临床上MRSA的检测提供了更多的便利。

2.1.1.2耐万古霉素肠球菌(VRE)的检测 吴薇等[21]基于MALDI-TOF MS发现了两个差异峰存在于VRE与万古霉素敏感肠球菌(VSE)之间，分别为3 516.14、3 644.12 m/z，可以用于VRE的初筛。陆文香等[22]用MALDI-TOF MS(检测仪器为德国布鲁克公司的产品)检测出2 194.94、3 022.15、3 167.47、4 058.08 m/z的质谱峰是用于区分VRE和VSE的最主要特征峰，且灵敏度、特异度均高于80%，使得对VRE和VSE的鉴别更加明确。同年，HUANG等[23]用MALDI-TOF MS检测VRE，灵敏度及特异度均在90%以上，与ChromID VRE产色琼脂培养基检测相比，TAT缩短到了29 h并且检测成本较低。 MALDI-TOF MS对于耐药菌特征峰的检测，结果可靠、省时、节省成本，是一种检测VRE的好方法。

2.1.2直接检测耐药菌所产酶 β-内酰胺酶包括超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)、广谱酶、碳青霉烯酶[A类如KPC酶，B类为金属β-内酰胺酶(MBL，简称金属酶)，D类如OXA酶]、头孢菌素酶(Amp C酶)等，可以水解β-内酰胺类抗菌药物从而造成菌株耐药。耐药脆弱拟杆菌的DNA包含cfiA基因，可编码一种MBL。NAGY等[24]用MALDI-TOF MS得出cfiA阳性和cfiA阴性的脆弱拟杆菌在4 000～5 500 m/z的质谱峰存在着差异，即cfiA基因阴性菌株位于4 711、4 817 m/z处的峰，在cfiA基因阳性菌株中分别漂移到了4 688、4 826 m/z处，于是可以区分cfiA阳性菌株与cfiA阴性菌株，从而筛选出产MBL的菌株。ESPINOSA等[25]用MALDI-TOF MS发现39 800 m/z左右的峰仅出现在产CMY-2型Amp C酶的菌株中，并且灵敏度和特异度均为100%，可以用于此类产酶菌的检测。CHANG等[26]用MALDI-TOF MS检测到了鲍曼不动杆菌的ADC型Amp C酶，对应40 279 m/z左右的质谱峰，灵敏度和特异度分别为96%、73%。ROCCO等[27]用MALDI-TOF MS成功检出了肺炎克雷伯菌的p019蛋白即对应11 109 m/z处的质谱峰，该峰几乎存在于所有产KPC酶的菌株中，灵敏度、特异度分别为95.7%、100.0%，可以作为产KPC酶菌株的相关峰，与常规方法相比，TAT缩短到了24 h。FIGUEROA-ESPINOSA等[28]用MALDI-TOF MS测得28 544 m/z的峰仅存在于产KPC-2酶的菌株中，灵敏度、特异度均为100%，可将其作为产KPC-2酶菌株的特征峰。这些研究说明用MALDI-TOF MS检测细菌所产酶的灵敏度、特异度均很高，并且可以起到缩短TAT的作用，进而为产酶菌的鉴定提供了一种新方法。

2.1.3直接检测耐药菌的细胞组分 (1)外膜蛋白。外膜蛋白可以调节抗菌药物进出细菌，其缺失或减少是耐药菌的耐药机制之一。OmpC、OmpF是大肠埃希菌主要的外膜蛋白，HU等[29]报道，用MALDI-TOF MS检测大肠埃希菌时并未发现37 000、38 000 m/z处的质谱峰，即代表该菌株属于大肠埃希菌EC1-EC3、EC6-EC8菌株，因为这类菌株不能表达外膜蛋白OmpC、OmpF。OmpK35、OmpK36是肺炎克雷伯菌主要的膜孔蛋白，PINTO等[30]通过MALDI-TOF MS发现膜孔蛋白OmpK36对应于38 700 m/z的峰，此次，对膜孔蛋白OmpK35的检测并不足，但是MALDI-TOF MS凭借节省时间这一大优势，足以替代十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)应用于快速鉴定膜孔蛋白OmpK36缺少的肺炎克雷伯菌，为后期的抗菌治疗提供针对性的依据。该研究团队还发现外膜蛋白OmpA对应于36 000 m/z的峰，OmpA也是大肠埃希菌具有的一种外膜蛋白。涂海健等[31]用MALDI-TOF MS检测出了外膜蛋白OmpK35，其对应于37 200 m/z的峰，而SDS-PAGE并不能将其检出，这更说明了MALDI-TOF MS在检测细菌外膜蛋白方面更胜一筹。通过直接检测细菌的外膜蛋白，将MALDI-TOF MS用于耐药菌的筛选，使得耐药菌的检测路径更加多样化。(2)脂多糖。脂多糖是革兰阴性菌细胞外壁的重要组分，其结构之一为脂质A。肠杆菌科细菌对多黏菌素的耐药性多与脂多糖的修饰有关，例如脂质A的磷酸乙醇胺(pETN)修饰和4-氨基-L-阿拉伯糖(L-Ara4N)修饰。DORTET等[32]开发了一种基于MALDI-TOF MS的MALDIxin试验，即用于检测对多黏菌素耐药的革兰阴性菌，在这类菌中发现了脂质A的pETN修饰，即在天然脂质A质谱峰(1 796 m/z)的基础上增加了123 m/z。该团队又对MALDIxin试验进行了优化，即增加了温和酸水解步骤，不仅发现了脂质A的pETN修饰，还快速鉴定出被L-Ara4N修饰的脂质A，因此优化后的MALDIxin试验可以更好地用于多黏菌素耐药菌的检测[33]。MALDI-TOF MS可以通过直接检测脂多糖从而鉴定出因脂多糖的修饰而产生耐药的细菌，可见，这种质谱方法能够依据细菌的耐药机制针对性地对细菌进行检测。

2.2间接检测

2.2.1根据抗菌药物的改变 细菌产生的酶可以使抗菌药物发生诸多改变，如水解、脱羧、乙酰化等，从而造成菌株耐药，MALDI-TOF MS常常可以根据抗菌药物的改变将耐药菌检测出来。携带KPC-2、NDM-1和VIM-1/2、IMP-1/2酶的菌株可以将厄他培南完全降解。BURCKHARDT等[34]用MALDI-TOF MS发现当这类产酶菌存在时，476、498、521 m/z的厄他培南峰及其钠加合物峰完全消失，在此基础上出现了450 m/z的水解产物峰。HRABAK等[35]将美罗培南与携带KPC-2/3、OXA-48/162、VIM-1和NDM-1酶的肠杆菌科细菌以及携带NDM-1酶的鲍曼不动杆菌共孵育，用MALDI-TOF MS检测发现383、405、427 m/z的美罗培南完整峰消失的同时出现了358.5、380.5 m/z的脱羧产物峰，用于产碳青霉烯酶菌株的鉴定。SPARBIER等[36]将氨苄西林与大肠埃希菌DH5α共孵育时，用microflex LT(检测仪器为德国布鲁克公司的产品)可以检测到350.1、372.1、394.1 m/z的氨苄西林峰及其钠加合物峰，但与产碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌共孵育时，这3个峰均降低的同时出现了367.9、389.9、411.8、324.0 m/z的水解及脱羧产物峰。JOHANSSON等[37]将厄他培南与产KPC酶的肺炎克雷伯菌共孵育，与BURCKHARDT等[34]用MALDI-TOF MS测得的峰值相近，并未发现476、498、520、542 m/z的厄他培南完整峰，但新增了472、494、516、538 m/z的水解产物峰。LASSERRE等[38]借助产碳青霉烯酶肠杆菌科细菌(CPE)提出了一种基于MALDI-TOF MS计算MS比值的方法，即抗菌药物水解产物的峰值/(抗菌药物水解产物的峰值+抗菌药物的峰值)，当MS比值≥0.82时，该菌判定为CPE。CALDERARO等[39]将美罗培南与CPE共孵育，与HRABAK等[35]用MALDI-TOF MS测得的结果相近，并未发现384、406、428 m/z处的美罗培南完整峰，但出现了358、380、402、424 m/z的水解产物峰及脱羧产物峰，凭借美罗培南质谱峰的改变能够快速检测出CPE，同时，他们发现了不同酶降解抗菌药物的能力不同，产KPC酶的菌株在30 min后便可将美罗培南完全降解，而产MBL的菌株则需在1 h后才能将美罗培南完全降解。冯丽娜等[40]将亚胺培南与CPE共孵育时，发现(300.00±0.55)m/z的亚胺培南峰完全消失,因此，MALDI-TOF MS也可以借助亚胺培南将CPE检出。AAC(6′)-Ⅰb酶是一种重要的氨基糖苷乙酰基团转移酶，其突变体AAC(6′)-Ⅰb-cr酶能够使氨基糖苷类抗菌药物和氟喹诺酮类抗菌药物失去活性。PARDO等[41]通过MALDI-TOF MS发现当肠杆菌科细菌产生AAC(6′)-Ⅰb-cr酶时，乙酰化的改变会使抗菌药物的相对分子质量增加42 000，可以用于此类产酶菌的鉴定。OVIAO等[42]用MALDI-TOF MS检测大肠埃希菌对诺氟沙星和环丙沙星的乙酰化改变时，也得到了相似的结果，+相对分子质量43 000峰可以用于鉴定产AAC(6′)-Ⅰb-cr酶的肠杆菌科细菌，此过程在1 h内即可完成。MALDI-TOF MS操作简便、高效，可以将其应用于不同产酶菌的检测中。

2.2.2根据有无抗菌药物时细菌的质谱差异 抗菌药物会抑制敏感菌的生长，使其浓度大大降低，质谱峰强度变弱，而对耐药菌无抑制作用，因而耐药菌的质谱峰强度相对较强，根据有无抗菌药物时质谱峰的ROC曲线下面积(AUC)可以判断细菌是否耐药。JUSTESEN等[43]利用一种基于MALDI-TOF MS的细菌药敏测试方法，即MALDI Biotyper药敏试验快速测定法(MBT-ASTRA)，将脆弱拟杆菌分别置于含及不含抗菌药物的培养基中进行培养，最终根据AUC计算相对生长率(RG)，RG值为含抗菌药物的AUC与不含抗菌药物的AUC的比值，以界定细菌耐药与否，RG<0.4判定为敏感菌株，RG>0.4则判定为耐药菌株。根据这个方法，研究者可以通过将不同抗菌药物与细菌相结合的方式来鉴定细菌的药物敏感或耐药。

2.2.3同位素标记联合抗菌药物共孵育 用同位素对培养基中的某种特定氨基酸进行标记，当加入抗菌药物时只有耐药菌可以利用经标记的氨基酸顺利生长并合成新的蛋白质，使得质谱峰的位置发生偏移或出现新的质谱峰，通过MALDI-TOF MS可以从诸多菌株中鉴别出耐药菌，目前这种联合法已用于对MRSA的检测中。SPARBIER等[44]将试验菌株同时置于“正常”(正常赖氨酸)、“重”(13C615N2标记的赖氨酸)以及“重+抗菌药物”(13C615N2标记的赖氨酸+苯唑西林)培养基中进行培养，用MALDI-TOF MS检测发现耐药菌的“重+抗菌药物”谱与“重”谱十分相似，而敏感菌的“重+抗菌药物”谱更接近“正常”谱，从而可以用于MRSA的鉴定。DEMIREV等[45]用大肠埃希菌来检验同位素标记的性能，将大肠埃希菌置于未标记和13C标记的培养基中进行培养，并成功检测了其对链霉素的耐药性。JUNG等[46]将铜绿假单胞菌置于“正常”“13C615N2标记的赖氨酸”以及“13C615N2标记的赖氨酸+抗菌药物”培养基中进行培养，用MALDI-TOF MS检测了其对美罗培南、环丙沙星和妥布霉素的敏感性。所以将同位素标记结合抗菌药物运用到MALDI-TOF MS对耐药菌的检测中也是一种鉴定病原菌的好方法，但前提是需要已知培养基中含有某种特定的氨基酸，这个过程可能有些烦琐。

2.2.4内标联合抗菌药物共孵育 内标为分子量稳定且与细菌蛋白的分子量有明显差异的蛋白质，将细菌与抗菌药物共孵育、裂解并加入内标，通过MALDI-TOF MS测得质谱峰的分布情况可以将敏感菌与耐药菌区分开来。LANGE等[47]利用MALDI-TOF MS对肺炎克雷伯菌进行了研究分析，发现当抗菌药物存在时敏感菌质谱图主要包含内标质谱峰，而耐药菌除内标质谱峰外，不论在有或没有抗菌药物存在的条件下均可呈现多个细菌质谱峰，于是可以很好地用于耐药菌的检测。

3 小 结

如今MALDI-TOF MS在常规标本病原菌的鉴定和细菌耐药性的检测方面取得了较好的发展，在未来它同样具备很大的潜力，需要研究者不断地优化、发掘。各实验室应建立符合自己实验室的MALDI-TOF MS检测体系，规范标本前处理、基质选择等，缩短TAT，为临床提供准确的检验报告，指导细菌感染患者的救治。但MALDI-TOF MS的应用目前也存在许多不足：(1)MALDI-TOF MS在临床微生物检测的运用上并没有普及化，众多检验科室因各种原因将MALDI-TOF MS检测仪器闲置。(2)虽然MALDI-TOF MS检测过程中相比常规方法节约成本，但其仪器成本并不低，这也是其无法做到临床普及化的原因之一。(3)由于是对蛋白质进行测定，对于蛋白含量较少的细菌，其标本制备难度较大；对细菌的纯度要求较高，这对难培养细菌的检测造成了困扰。(4)对于亲缘性相近的菌株不能很好地区分。(5)质谱库无法做到完整和统一，需要实验室各自建立适合自己的质谱库，这将是一个浩大的工程，可行性较差。(6) 目前MALDI-TOF MS只能分别检测细菌对不同抗菌药物的耐药性，不能同时进行药敏分析。(7)MALDI-TOF MS只能对蛋白质进行定性检测，也就是说只能检测菌株的存在与否，无法通过它得知病原菌的具体含量。