南极磷虾油醇提工艺优化及其虾青素热稳定性研究

周庆新，谷彩霞，陈芳甜，李玉环

（日照职业技术学院海洋技术系，山东省海洋甲壳类资源综合利用工程技术研究中心，山东省海洋食品资源高效利用技术工程实验室，日照市海洋食品资源高效利用重点实验室，山东日照 276826）

南极磷虾是一种主要分布于南冰洋的浮游甲壳动物，其巨大的生物量和潜在的开发价值日益受到人们的关注[1]。在以南极磷虾为原料开发的产品中，以南极磷虾油最具代表性[2]，其中富含磷脂、n-3多不饱和脂肪酸、虾青素等多种功能伴随物[3]。诸多研究表明，南极磷虾油具有抗氧化[4]、改善脂代谢[5]、抗肿瘤[6]、保护神经和改善认知功能[7-8]、防治人类肠道疾病[9]、抗疲劳[10]等多种功效，开发潜力非常大。

传统南极磷虾油的提取主要采用机械压榨法和有机溶剂萃取法两种[3,11]。近年来，随着高新技术快速发展，超临界流体CO2萃取技术和亚临界流体萃取技术因绿色无污染、选择性高等优势，逐渐被应用于南极磷虾油的提取研究，但因设备投入昂贵、运行维护成本高、提取条件苛刻等缺陷，难以实现大规模产业化应用[12-13]。同时，酶解法作为新兴的油脂提取工艺也被用于南极磷虾油的制备，而专用酶制剂的价格高、体系专一性要求严格，使其在磷虾油生产中的应用亦受到限制[14-16]。而传统机械压榨法虽然设备简单且无溶剂残留问题，但是存在得率低、精制纯化难度大等问题[17]。与上述方法相比，有机溶剂萃取法因得率高、操作简单、成本低等优势，而被广泛用于南极磷虾油的规模化生产[18-19]。目前南极磷虾油生产中常选用乙醇、乙酸乙酯、正己烷等作为萃取剂，其中，乙酸乙酯和正己烷因溶剂残留和安全性等问题而受到一定限制，因此生产中大多选用乙醇作为溶剂。然而现有的南极磷虾油乙醇提取工艺条件粗放，评价指标单一，有待进一步优化完善。

同时，作为南极磷虾油中主要抗氧化成分的虾青素性质极不稳定，在高温加工和贮藏中易遭到破坏，导致产品感官质量和功能活性下降[20]，故研究南极磷虾油中虾青素的稳定性及其改善方法显得尤为重要。鉴于上述，本实验以南极磷虾粉为原料，以乙醇-水体系为提取剂，研究不同乙醇水比例、液料比、提取时间对磷虾油得率、磷脂和总虾青素含量的综合影响，在单因素实验的基础上，通过构建提取效果量化评价方法，采用响应面对南极磷虾油的提取条件进行优化，以克服传统采用单一指标进行响应面优化的片面性。另外，通过在南极磷虾油中添加不同抗氧化剂，并结合动力学模型，评价南极磷虾油中虾青素在连续高温条件下的耐热稳定性，以期为南极磷虾油的工业化生产和稳态化贮藏提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

南极磷虾粉 山东辰亚生物科技有限公司提供；无水乙醇、抗坏血酸、钼酸铵等 分析纯，国药集团；TBHQ、迷迭香提取物、生育酚 上海瑞祥生物科技有限公司；白油 食品级，上海毅资润滑技术有限公司；总胆固醇检测试剂盒 中生北控公司。

UV-2550紫外分光光度计 日本岛津公司；Heidolph Laborota 4000型旋转蒸发仪 德国Heidolph公司；1260型液相色谱仪（配置二极管阵列检测器）、6890N型气相色谱（配备火焰离子化检测器（FID）） 美国Agilent公司；CP214型精密电子天平 奥豪斯仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 南极磷虾油醇提工艺及其提取效果指标的检测方法

1.2.1.1 南极磷虾油的醇提工艺 通过前期预实验，确定南极磷虾油的提取方法如下：准确称取100.000 g（精确至0.001 g）南极磷虾干粉于三角瓶中，分别用一定体积分数的乙醇-水溶液作为提取溶剂，按照一定的液料比，在室温条件下（25 ℃）搅拌提取一定时间，搅拌速度为400 r/min。提取结束后抽滤，收集提取液，经真空旋转蒸发浓缩至无溶剂流出，得到南极磷虾油。冷却至室温后称重，计算得率，并测定所得南极磷虾油中的磷脂和总虾青素含量。

1.2.1.2 南极磷虾油提取得率计算 南极磷虾油得率按式（1）计算。

式中：M1为磷虾油质量（g）；M2为干燥虾粉质量（g）。

1.2.1.3 磷脂含量测定方法 采用抗坏血酸-钼蓝比色法。参照孙甜甜[21]的测定方法，准确称取2 g（精确至0.0001 g）样品，加25 mL的浓硝酸与高氯酸混合溶液（浓硝酸:高氯酸=4:1，V/V）浸泡，冷消化2 h，再进行灰化，在抗坏血酸存在的条件下与钼酸铵反应生成钼蓝，测定其在650 nm下的吸光度，通过标准曲线法来测算磷虾油中磷脂的含量。磷脂的标准曲线方程为：Y=3.707X-0.026，R2=0.9999。

1.2.1.4 虾青素含量测定方法 根据Zhou等[22]的方法，称取南极磷虾油15 mg（精确至0.0001 g），置于带有刻度的具塞玻璃离心管中，再向离心管中加入二甲基亚砜和醋酸的混合溶液（配制方法：量取2.5 mL醋酸溶液，将其添加到100 mL二甲亚砜溶液中即得）2 mL，摇匀后，于70 ℃水浴条件下振荡保温5 min，然后将溶液转移至100 mL容量瓶中，用二甲亚砜和醋酸混合溶液定容至刻度，测定其在489 nm波长下吸光度值，记为A。以二甲基亚砜和醋酸的混合溶液作为空白对照。按式（2）计算总虾青素含量。

式中：X为虾青素的总含量（mg/kg）；A489为样品在489 nm下的吸光度；V为提取样品的体积（mL）；A为稀释倍数；1908为消光系数；m为样品质量（g）。

1.2.2 单因素实验 准确称取100.000 g（精确至0.001 g）南极磷虾干粉，固定搅拌速度为400 r/min，提取温度为室温，按液料比为10 mL/g，分别用体积分数为80%、85%、90%、95%和100%的乙醇作为溶剂搅拌提取120 min，考察溶剂对南极磷虾油得率、磷脂和总虾青素含量的影响。分别按液料比4、6、8、10、12、15 mL/g，用体积分数为95%的乙醇搅拌提取120 min，考察液料比对南极磷虾油得率、磷脂和总虾青素含量的影响。按液料比为10 mL/g，分别用体积分数为95%的乙醇-水溶液搅拌提取30、60、90、120、150和180 min，考察提取时间对南极磷虾油得率、磷脂和总虾青素含量的影响。

1.2.3 响应面设计试验

1.2.3.1 南极磷虾油提取效果量化评价指标计算为克服采用单项指标对南极磷虾油提取效果进行评价的局限性，本试验尝试通过对磷虾油得率、磷脂和总虾青素含量三个指标进行分类量化，系统评价不同提取工艺对南极磷虾油提取效果的影响。根据目前市场对南极磷虾油提取效果指标的综合考量，设置各项量化指标的赋分说明及相应权重见表1，按照式（3）计算南极磷虾油的提取效果。

式中：t为南极磷虾油得率的赋分值；p为磷脂含量的赋分值；x为总虾青素含量的赋分值。

1.2.3.2 试验设计 依据Box-Behnken试验设计原则，以综合量化提取效果为响应值，试验设计中的水平及编码见表2。运用Design expert 10.0软件进行数据分析，以优化得到最佳南极磷虾油醇提工艺条件。

表 1 南极磷虾油提取指标赋分说明及相应权重Table 1 Scoring description and corresponding weight of extraction index of Antarctic krill oil

表 2 Box-Behnken设计因素及水平Table 2 Box-Behnken design factors and levels

1.2.4 主要活性成分测定

1.2.4.1 胆固醇测定方法 总胆固醇的含量采用中生北控公司的总胆固醇检测试剂盒进行测定。准备称取1.0000 g（精确至0.0001 g）最佳工艺条件制备的南极磷虾油，加入9 mL无水乙醇，冰浴条件下充分匀浆提取，然后经2500 r/min离心10 min，取上清液测定其总胆固醇含量。

1.2.4.2 维生素A和维生素D测定方法 南极磷虾油中维生素A、维生素D的测定方法按照GB 5009.82-2016中的反相液相色谱法[23]。

1.2.4.3 脂肪酸的气相色谱法测定 参照孙甜甜[21]的测定方法，称取制得的南极磷虾油50～100 mg，加入1.5 mL 10%硫酸-甲醇溶液，于60 ℃下充氮保护反应30～40 min，冷却，用1.5 mL石油醚振荡提取，静置10 min。取上层石油醚溶液，用0.22 μm有机膜过滤后，经气相色谱分析。

气相色谱条件：色谱柱为INNO Wax石英毛细管柱（0.32 mm×30 m×0.25 μm，J ＆W）；升温程序：起始温度为170 ℃，以3 ℃/min的速度升温到210 ℃，210 ℃保持30 min；检测器温度为250 ℃；氢气流速40 mL/min，空气流速450 mL/min，尾吹气（氮气）流速40 mL/min；进样口温度为240 ℃；载气为高纯氮气，流速为1 mL/min；分流比20：1；进样量为1 μL；单个样品分析过程为43.3 min。

1.2.5 南极磷虾油的稳定性实验 本实验选用TBHQ、迷迭香提取物、生育酚作为抗氧化剂，并依据GB 2760-2014确定三种抗氧化剂使用量[24]。具体试验方法如下：分别将添加0.02%（w/v）TBHQ、0.02%（w/v）迷迭香提取物、0.02%（w/v）生育酚、0.02%（w/v）迷迭香提取物+0.02%（w/v）生育酚的南极磷虾油样品溶于白油中，于80 ℃水浴中加热，以10 min为时间间隔进行取样，测定其在457 nm下的吸光度值，按式（4）计算各样品中总虾青素保留率。

式中：At为t时刻样品在457 nm下的吸光度值；A0为起始时间样品在457 nm下的吸光度值。

1.3 数据处理

实验过程中，每个实验组均设三个平行，实验数据以平均值±标准差表示，选用SPSS 19.0软件进行统计学分析，以P＜0.05为显著水平。

2 结果与分析

2.1 南极磷虾油提取工艺的单因素实验

2.1.1 乙醇体积百分数对磷虾油提取效果的影响图1结果表明，体积分数为85%的乙醇作为提取溶剂时，磷虾油得率最高，而磷脂和虾青素含量较低，可能是因为一定比例水分的存在，将南极磷虾粉中的部分蛋白质、矿物质等水溶性组分提取出来所致[25-26]，从而使得到的磷虾油综合品质较低，但由于生产成本相对较低，该条件下生产的磷虾油可作为饲料级产品；体积分数为100%的乙醇溶液作为提取剂时，磷脂和总虾青素含量高，而虾油得率较低，而且无水乙醇提取成本较高，该提取物可作为高端保健功能辅料进行生产。因此，从生产成本和主成分含量的角度综合考虑，选用体积分数为95%的乙醇-水溶液作为提取剂较合理。

2.1.2 不同液料比对磷虾油提取效果的影响 由图2可知，随着提取剂的体积增大，磷虾油得率、磷脂含量和总虾青素含量均呈逐渐升高的趋势。但当液料比达到10 mL/g以后，继续增大提取剂体积，磷虾油得率和虾青素含量变化不显著（P＞0.05）。说明在液料比为10 mL/g的条件下，南极磷虾粉中脂溶性成分接近提取完全。故综合考虑成本与含量，液料比为10 mL/g时提取效果相对较佳。

图 1 不同浓度乙醇对磷虾油提取效果的影响Fig.1 Effect of different concentrations of ethanol on the extraction of Antarctic krill oil

图 2 不同液料比对磷虾油提取效果的影响Fig.2 Effect of different liquid-solid ratios on the extraction of Antarctic krill oil

2.1.3 不同提取时间对磷虾油提取效果的影响 由图3可知，随着提取时间的延长，磷虾油得率、磷脂、总虾青素含量均呈逐渐增大的趋势。当提取时间达120 min时，磷虾油得率、磷脂含量和总虾青素含量均显著高于30、60和90 min（P＜0.05）。而后随着时间的继续延长，三者数值变化不显著（P＞0.05）。故优化提取时间为120 min。

2.2 响应面试验结果

2.2.1 Box-Behnken 试验设计结果 根据单因素实验结果，选取对南极磷虾油提取效果影响较大的3个因素：乙醇浓度、液料比和提取时间，各取3个水平分别记为水平-1、0、1，进行因素水平共17个试验点的响应面分析试验，响应曲面法的试验设计及结果见表3。

运用Design expert 10.0数据分析软件对试验数据进行多元回归拟合，设乙醇浓度、液料比和提取时间分别为A、B、C，以南极磷虾油提取效果为响应值进行多元回归拟合，回归模型系数及显著性检验结果见表4，得到二次多项回归模型：

表 3 响应面试验设计及结果Table 3 Design and results of response surface test

表 4 拟合二次多项式模型的方差分析Table 4 Analysis of variance of the fitted quadratic polynomial model

进一步对该模型及回归系数进行回归分析，结果见表4，从表4可以看出该回归模型P＜0.01（极显著），其失拟项P=0.1317＞0.05（不显著），说明模型拟合程度良好，可以对回归方程相应回归值进行预测，同时模型回归系数R2=0.9700，调整后的R2=0.9314（大于0.8000），表明93.14%的数据可用该模型解释，说明方程可靠性较高。

通过分析相关数据可以看出，一次项乙醇浓度和提取时间对南极磷虾油提取效果具有极显著影响（P＜0.01），液料比对南极磷虾油提取效果具有显著影响（P＜0.05），分析各因素的主效应关系为：A＞C＞B，即乙醇浓度＞提取时间＞液料比。其二次项交互作用BC对南极磷虾油提取效果具有显著影响（P＜0.05），AB、AC对南极磷虾油提取效果的影响不显著（P＞0.05），且二次项交互作用对南极磷虾油提取效果影响程度为BC＞AC＞AB。

2.2.2 响应面曲线交互作用分析 根据回归方程，考察响应面曲面图及等高线图的形状，分析乙醇浓度、液料比和提取时间对南极磷虾油提取效果的影响。响应面曲面图和等高线可以很好地反映自变量之间的相互作用。通过观察响应曲面图的坡度陡峭程度，确定两者对响应值的影响程度，响应面曲面图越陡峭说明两者的交互作用越明显。乙醇浓度、液料比、提取时间对南极磷虾油提取效果的影响见图4。

由图4a可知，南极磷虾油提取效果的变化坡度随液料比的增加呈缓慢增加的趋势，随乙醇浓度的增加呈逐渐增加的趋势，且磷虾油提取效果随乙醇浓度的变化陡峭程度大于液料比，说明乙醇浓度对磷虾油提取效果的影响大于液料比的影响；由图4b可知，磷虾油提取效果的变化坡度随乙醇浓度的增加呈逐渐增加的趋势，其磷虾油提取效果随着提取时间的增加呈逐渐增加的趋势，且磷虾油提取效果随乙醇浓度的变化陡峭程度大于提取时间，说明乙醇浓度对磷虾油提取效果的影响大于提取时间的影响；由图4c可知，磷虾油提取效果的变化坡度随提取时间的增加呈逐渐增加的趋势，当提取时间较短时，随着液料比的增加，磷虾油提取效果逐渐增加，当提取时间较大时，随着液料比的增加，磷虾油提取效果先逐渐降低后缓慢增加，说明液料比和提取时间具有较强的交互作用，且磷虾油提取效果随提取时间的变化陡峭程度大于液料比，说明提取时间对磷虾油提取效果的影响大于液料比的影响。上述分析结果与表4方差分析结果相符合。

图 4 乙醇浓度和液料比（a）、乙醇浓度和提取时间（b）、液料比和提取时间（c）三因素交互作用响应曲面和等高线图Fig.4 Response surface and contour plots for the interactive effects of ethanol concentration and liquid-solid ratio (a), ethanol concentration and extraction time (b), liquid-solid ratio and extraction time (c) on the extraction of Antarctic krill oil

2.2.3 验证实验结果 根据回归方程模型，得到预测的最优条件为：乙醇浓度为94.996%、液料比为9.995 mL/g、提取时间为137.285 min，根据实验实际条件，将条件修正为乙醇浓度为95%、液料比为10 mL/g、提取时间为137.3 min，在此最优条件下经3次平行实验，得到实际南极磷虾油得率、磷脂和总虾青素含量分别为13.6%±1.2%、33.62%±2.48%、210.46±5.95 mg/kg，提取效果量化值为4.12，与预测值4.108差异较小，证明用响应面法优化南极磷虾油提取效果回归模型可靠。

2.3 南极磷虾油组成分析

2.3.1 主要功效成分分析 以优化工艺提取所得的磷虾油为对象，经分析测得其中的主成分含量如表5所示。

表 5 南极磷虾油中主要功效成分分析Table 5 Analysis of main bioactive components of Antarctic krill oil

由表5可以看出，所得南极磷虾油中富含磷脂、虾青素和脂溶性维生素等多种营养成分，可作为功能保健辅料和营养强化剂应用于食品和保健品领域。另外，测得虾油中总胆固醇的含量约为20.53 mg/g。假设按照每人每天最高推荐摄入南极磷虾油3 g计算[27]，其中共含总胆固醇约77 mg。

2.3.2 主要脂肪酸组成分析 为了进一步考察优化工艺条件下提取所得南极磷虾油中脂肪酸的组成情况，本实验采用气相色谱法对南极磷虾油中的脂肪酸进行定性定量表征，经峰面积归一化处理，得到南极磷虾油中脂肪酸组成及相对含量如表6所示。

表 6 南极磷虾油的脂肪酸组成分析Table 6 Analysis of fatty acid composition of Antarctic krill oil

从表6中可以看出，优化工艺条件下制备的南极磷虾油中饱和脂肪酸的相对含量约为40.24%，其中棕榈酸（C16:0）含量最高；单不饱和脂肪酸相对含量约为18.05%，其中油酸（C18:1）含量最高；多不饱和脂肪酸相对含量约为41.58%，其中EPA（C20:5）和DHA（C22:6）总量之和约为37.42%。体积分数为95%的乙醇-水溶液对极性脂的提取效果良好，而磷虾油中的EPA和DHA大多与和磷脂结合在一起[21,28]，故EPA和DHA可随着磷脂等极性脂被较好地提取出来。

2.4 南极磷虾油中虾青素稳定性分析

2.4.1 不同抗氧化剂对南极磷虾油中虾青素保留率的影响 虾青素作为南极磷虾油中重要的功能伴随物，极易发生氧化降解，因此，可将其作为评价南极磷虾油贮藏稳定性的重要指标[29]。根据孙甜甜[21]的研究发现，添加一定量抗氧化剂可有效增加南极磷虾油抗氧化性，延长其货架期。综合考虑有效性和安全性，本试验选用TBHQ、迷迭香提取物和生育酚作为抗氧化剂，通过单独和复合添加到南极磷虾油中，采用高温（80 ℃）加速实验的方法，考察其对南极磷虾油耐热稳定性的影响，实验结果如图5所示。

图 5 不同抗氧化剂对南极磷虾油中虾青素保留率的影响Fig.5 Effects of different antioxidants on astaxanthin retention in Antarctic krill oil

由图5可以看出，随着加热时间的延长，未添加抗氧化剂的磷虾油中虾青素保留率显著降低，当加热到80 min时，总虾青素的保留率已不足50%。而添加抗氧化剂后，磷虾油中的总虾青素保留率显著高于空白组（P＜0.05），且以添加迷迭香提取物（0.02%，w/v）+生育酚（0.02%，w/v）的复合抗氧化剂实验组效果最佳，当连续加热至80 min时，总虾青素保留率仍维持在95%以上，说明通过添加复配抗氧化剂可以显著提高磷虾油的耐热稳定性。

2.4.2 不同温度条件下南极磷虾油中总虾青素的加工和贮藏半衰期预测分析 为进一步考证不同抗氧化剂对南极磷虾油稳定性的影响，本部分对不同加工和贮藏温度下南极磷油的耐热稳定性进行了预测。Niamnuy等[30]研究表明，虾青素的降解遵循一级动力学反应模型。因此，该实验以南极磷虾油中总虾青素半衰期为评价指标，结合不同处理温度条件下南极磷虾油中总虾青素含量变化数据，经降解动力学分析，计算得到总虾青素的半衰期如表7所示。

表 7 不同温度条件下南极磷虾油中总虾青素的加工和贮藏半衰期预测Table 7 Analysis of processing and storage half-value of total astaxanthin in Antarctic krill oil at different temperature conditions

由表7可以看出，在不同的温度条件下，抗氧化剂组总虾青素的半衰期均显著高于空白组，其中以复配抗氧化剂（迷迭香提取物+生育酚）实验组的南极磷虾油虾青素半衰期最长，比空白组延长了9倍以上，两者表现出协同增效作用。McClements等[31]报道，复配抗氧化剂通常比单一抗氧化剂在抑制氧化降解方面更为有效，本实验结果与之相符。

3 结论

本研究确定南极磷虾油的优化提取工艺条件为：乙醇浓度为95%、液料比为10 mL/g、提取时间为137.3 min，该工艺条件下南极磷虾油的提取得率为13.6%，且富含磷脂、虾青素、维生素E和维生素A等功效成分，其中多不饱和脂肪酸含量约占总脂肪酸的41.58%，营养价值优良。虾青素稳定性实验结果表明，添加抗氧化剂可显著提高南极磷虾油的耐热稳定性，且以迷迭香提取物和生育酚复配效果最佳。动力学模型预测显示，在相同加工和贮藏温度下，添加复配抗氧化剂的南极磷虾油中虾青素半衰期比未添加抗氧化剂组明显延长。综上所述，本实验为南极磷虾油的工业化生产、应用及其长期稳定保存提供了切实可行的技术支持，具有重要应用价值。