高压脉冲电场对果胶杆菌的杀菌效果及其致死动力学研究

张元元，赵欢欢，李国锋，郝浩然，张映曈,4，李鹏霞,,,4,5,

（1.南京农业大学食品科技学院，江苏南京 210095；2.江苏省农业科学院农业设施与装备研究所，江苏南京 210095；3.沈阳农业大学食品学院，辽宁沈阳 110065；4.农业农村部农产品冷链物流技术重点实验室，江苏南京 210095；5.江苏省高效园艺作物遗传改良重点实验室，江苏南京 210095）

高压脉冲电场技术是一种新型的非热杀菌技术，通过在两个电极板间瞬间产生的高脉冲电场来杀灭病原菌，能最大限度地保留食品的营养成分，目前已成为食品工业领域的研究热点[1]。高压脉冲电场的杀菌效果受多种因素影响，其中设备参数和微生物参数是两个重要的方面。不同的电场强度、杀菌时间和脉冲占空比处理下，微生物的死亡率不同，设备参数的设置与微生物的杀灭效果紧密相关[2]。不同微生物对高压脉冲电场的耐受程度不同，主要取决于其类型、生长时期、细胞壁的厚度等。一般认为革兰氏阴性菌比革兰氏阳性菌更敏感，营养细胞比孢子更敏感[3]。高压脉冲电场的杀菌机制是一大研究热点，目前存在多种假说，电崩解理论和电穿孔理论是最重要的两种[4]。其原理主要是通过对细胞膜结构和功能的破坏引起细胞内容物外泄，导致微生物死亡[5-6]，因而不会引起基质的显著温升，这对食品工业领域至关重要。

细菌性软腐病是一类危害严重的采后病害，造成严重的经济损失。该病害由多种病原细菌引起，其中最主要的是肠杆菌科（Enterobacteriaceae）的果胶杆菌属（Pectobacterium）和迪基氏菌属（Dickeya）[7]。其中果胶杆菌在全世界范围内寄主种类广泛，通过产生和分泌果胶酶和纤维素酶破坏植物细胞壁，进而导致其腐烂变质[8]。采后果蔬和甘薯等经济作物及其鲜切加工制品中常携带果胶杆菌，严重影响其贮运品质、大大缩短货架期，造成严重经济损失。另外，由此产生的食品安全问题也对消费者的生命健康造成极大威胁。目前，在采后及鲜切加工行业，主要采用的是臭氧、电解水、紫外线和次氯酸钠等传统杀菌方式。但通过以上杀菌方式存在不能广谱杀菌、残留水渍造成二次腐败、仅能杀灭直接照射区域以及存在化学残留等问题。因此亟需寻找一种高效安全的方式实现采后及鲜切加工制品中果胶杆菌以及其他致病菌的非热杀菌。

本研究拟以实验室前期在娃娃菜采后软腐病菜叶中分离鉴定的果胶杆菌C-11为模型，研究高压脉冲电场不同处理条件对果胶杆菌的杀灭效果，并通过测定处理后果胶杆菌的生长曲线、细胞膜脂肪酸、渗透率、蛋白质和核酸泄漏量等指标对高压脉冲电场杀菌机理进行初步探索，同时建立了高压脉冲电场-果胶杆菌致死动力学模型，为进一步实现高压脉冲电场杀菌保鲜在采后和鲜切行业的产业化应用提供参考数据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

普通肉汤培养基(Lysogeny broth, LB)、平板计数琼脂培养基(Plate count agar, PCA) 上海盛思生化科技有限公司；营养琼脂培养基(Nutrient agar medium, NA) 青岛海博生物技术有限公司；氯化钠（99%） 上海久亿化学试剂有限公司；次氯酸钠（98%） 西陇化工股份有限公司；无水乙醇 镇江久亿化学试剂有限公司。

DMC-200高压脉冲电源 大连鼎通科技发展有限公司；SW-CJ-1B型净化工作台 苏州净化设备有限公司；MIR234恒温培养箱 日本Sanyo公司；DW-86L486型超低温冰箱 Haier公司；PHSJ-3F型pH计 上海雷磁新径仪器有限公司；HH-S系列数显恒温水浴锅 常州万达升实验仪器有限公司；M603Di型电子天平 意大利Bel公司；3K15型高速台式冷冻离心机 Sigma公司；78-1磁力加热搅拌器 武汉格莱莫检测设备有限公司；FM40雪花制冰机 北京长流科学仪器公司；SC-329GA透明门立式冷藏柜 Haier公司；Eppendorf Bio Photometer plus紫外分光光度计 德国 Eppendorf公司；岛津GC-2010气相色谱仪 日本岛津制作所。

1.2 实验方法

1.2.1 果胶杆菌的活化 取本实验室前期保藏的果胶杆菌（Pectobacterium carotovorumC-11，本实验室保藏）菌液，接种至NA培养基。挑取果胶杆菌单菌落至LB液体培养基中，于30 ℃、200 r/min摇培6 h左右，离心后用生理盐水洗涤菌液3次后，调整悬浮液浓度为107～108CFU/mL。

1.2.2 高压脉冲电场处理 高压脉冲处理室的清洗消毒：每次实验前先用100 mg/L的次氯酸钠溶液清洗电极板和处理室，再用无菌水冲洗数次，用无菌纱布擦干积水。

取50 mL 107～108CFU/mL的果胶杆菌悬液，离心后用同等体积稀释50倍的生理盐水重悬，置于高压脉冲电场下处理。处理装置如图1所示，处理室宽度10 cm，电极板间距最低可调节至2.0 cm。处理条件为：设定电场强度分别为0、4、8、12、16、20、24、28、32和36 kV/cm，固定处理时间1 min、脉冲占空比49.2%、脉冲频率1000 Hz，作为考察电场强度影响作用的处理参数。设定脉冲占空比分别为0、6.5%、13.5%、20.5%、24.8%、30.9%、36.5%、42.6%和49.2%，固定电场强度28 kV/cm、处理时间1 min、脉冲频率1000 Hz，作为考察脉冲占空比影响作用的处理参数。设定脉冲频率分别为0、200、400、600、800和1000 Hz，固定电场强度28 kV/cm，处理时间1 min、脉冲占空比36.5%，作为考察脉冲频率影响作用的处理参数。设定处理时间分别为0、1、5、10和15 min，固定电场强度28 kV/cm、脉冲占空比36.5%、脉冲频率200 Hz，作为考察处理时间影响作用的处理参数。整个处理过程置于20±2 ℃室内进行。

图 1 高压脉冲电场处理装置示意图Fig.1 Schematic diagram of high voltage pulsed electric field treatment device

1.2.3 不同处理条件对果胶杆菌灭菌效果的影响取50 mL 107～108CFU /mL的果胶杆菌悬液，在不同电场强度、脉冲占空比、脉冲频率和时间条件下处理，梯度稀释后，分别吸取10-3、10-4和10-5稀释度的菌悬液100 μL，平板涂布后置于30 ℃恒温培养箱培养约20 h，记录平板上的菌落总数，以不做任何处理的菌悬液为对照。每个处理设3个平行，用活菌对数减少值Q来表示灭菌效果[9]。根据灭菌效果选择其中影响较显著的因素进行后续研究。

式中：N0表示高压脉冲电场处理前的活菌数，CFU/mL；N表示高压脉冲电场处理后的活菌数，CFU/mL。

1.2.4 电场强度和脉冲占空比对果胶杆菌生长曲线的影响 采用分光光度法测定不同时间果胶杆菌悬液的OD600值并绘制生长曲线[10]：分别吸取5 μL处理过（不同电场强度和脉冲占空比）和未处理的果胶杆菌悬液，接种至装有5 mL LB液体培养基的试管中。将所有试管置于30 ℃、200 r/min培养箱振荡培养，每隔2 h测量一次OD600值，测至第24 h，每个处理重复3次。以时间为横坐标，OD600值为纵坐标，作果胶杆菌的生长曲线图。

1.2.5 电场强度和脉冲占空比对果胶杆菌细胞膜脂肪酸含量的影响 根据Bligh & Dyer的方法[11]改良后进行脂肪酸提取：收集不同电场强度和脉冲占空比处理的菌体进行冷冻干燥，称取冻干菌体（20 mg）于提脂瓶中，加入2 mL 4 mol/L的盐酸溶液，80 ℃水浴30 min，期间反复振荡，置于-80 ℃超低温冰箱速冻15 min。反复冻融3次后室温融化提取脂肪酸。加入100 μL 2.02 mg/mL十五烷酸（C15: 0）为内标，同时加入1 mL甲醇，1 mL三氯甲烷。置于摇床250 r/min振荡30 min后3000 g离心5 min，取三氯甲烷层转移至干净提脂瓶中，重复三次。氮气吹干，加入1 mL 10%盐酸甲醇，60 ℃水浴3 h，加入1 mL饱和NaCl，2 mL正己烷，涡旋振荡，3000 g离心5 min，吸取正己烷层进行脂肪酸测定。

气相色谱（岛津GC-2010）程序[12]为：120 ℃，3 min，以5 ℃/min的速率升到200 ℃，再以4 ℃的速率升到220 ℃，保持2 min。色谱柱为DB-WAXETR（30 m×0.32 mm），膜厚度0.25 μm。检测器为氢离子火焰检测器，进样体积1 μL，分流比为10:1，载气为氮气。以内标为参照，分析各脂肪酸峰面积，并计算得到总脂肪酸和不饱和脂肪酸所占百分含量。计算公式为：

式中：Asi为单个脂肪酸对应的峰面积；A内标为内标对应的峰面积；c内标为内标的浓度（μg/μL）；V内标为内标体积（μL）；m称重为菌体重量（g）。

1.2.6 电场强度和脉冲占空比对果胶杆菌细胞膜通透性的影响 处理前的菌悬液（107～108CFU/mL），在25 ℃恒温水浴锅中用电导仪先测定溶液初始电导率，记为C0。处理后（不同电场强度和脉冲占空比）收集菌液后立刻放入25 ℃水浴锅以保持室温，测定电导率，计为C1。测完后，将所有试管放入沸水中煮10 min，冷却至25 ℃后再次测定各电导率值，记为C杀。根据以下公式计算相对电导率值（%），用相对电导率表示菌体细胞膜的通透性[13-14]，每个处理设3个平行。

式中：C0表示初始电导率值，%；C1表示处理后的电导率值，%；C杀表示煮沸杀死后的电导率值，%。

1.2.7 电场强度和脉冲占空比对果胶杆菌核酸和蛋白质泄漏量的影响 将配制好的107～108CFU/mL的菌悬液，置于不同电场强度和脉冲占空比条件下处理，取经过处理的果胶杆菌悬液于4 ℃、8000 r/min离心10 min，取上清20 mL，真空冷冻干燥（冷阱温度在-55至-40 ℃，真空度为5～100 mTorr，干燥时间24 h）浓缩后，以2 mL生理盐水重悬，使用微量分光光度计测定260 nm（核酸）和280 nm（蛋白质）OD值，每个处理设3个平行，对照为未处理的菌悬液，空白为生理盐水，通过胞外260 nm（核酸）和280 nm（蛋白质）OD值大小分析核酸和蛋白质泄露情况[9]。

1.2.8 高压脉冲电场对不同生长期果胶杆菌存活率的影响 设置电场强度分别为0、4、8、12、16、20、24和28 kV/cm，固定处理时间为1 min、脉冲占空比为36.5%、脉冲频率为200 Hz，或设置脉冲占空比分别为0、6.5%、13.5%、20.5%、24.8%、30.9%和36.5%，固定电场强度28 kV/cm、处理时间1 min、脉冲频率200 Hz，作为高压脉冲电场处理参数。收集不同生长期的菌液（培养5 h为延滞期，10 h为对数期，18 h为平台期），置于高压脉冲电场下处理，稀释后，分别吸取10-3、10-4和10-5稀释度的菌悬液100 μL，平板涂布后置于30 ℃恒温培养箱培养约20 h，记录平板上的菌落总数，用存活率S来表示灭菌效果。

式中：N0表示高压脉冲电场处理前的活菌数，CFU/mL；N表示高压脉冲电场处理后的活菌数，CFU/mL。

1.2.9 存活率与各处理条件的动力学模型建立 本实验以Hülsheger模型[15]来分析处理条件与果胶杆菌存活率之间的关系。根据Hülsheger模型，假设微生物数量的变化与处理条件的变化程度成正比，即呈一级反应关系，比例系数为KP。以上假设可以用式（7）表示：

Hülsheger模型：

结合式（6）、（7）得：

由式（8）得

式中：S=NP/N0表示存活率，%；N0和NP分别表示高压脉冲电场处理前后的微生物数量，CFU/mL；E为实际应用的电场强度；Kp、bE为回归系数，表示微生物对高压脉冲电场敏感性的参数，其值越大，微生物对处理条件越敏感，杀灭效果也越好，这与微生物种类和介质有关；Pc、EC指处理条件的临界值，表示微生物的存活率刚刚低于100%时所需要的处理条件参数；P指处理条件（电场强度、占空比等）。

以果胶杆菌对数减少值lnS为纵坐标，电场强度或脉冲占空比为横坐标，作不同电场强度和脉冲占空比对果胶杆菌的致死动力学图。

以果胶杆菌存活率为纵坐标，电场强度或脉冲占空比为横坐标，作不同电场强度和脉冲占空比对果胶杆菌致死作用的拟合曲线图。

对实验的结果和拟合的预测值进行方差分析，如果两组数据没有差异性即说明模型准确性较高。

1.3 数据处理

所有数据用Excel、SPSS 20、Origin 8.5分析软件进行统计处理，利用邓肯氏多重比较法在P=0.05的水平下进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 不同处理条件对果胶杆菌灭菌效果的影响

经不同条件脉冲电场处理后，菌悬液中活菌对数减少值与处理条件之间的关系如图2所示。由图2A可以看出，随电场强度的增大，果胶杆菌的活菌对数减少值逐渐增大，当电场强度为28 kV/cm时，杀菌效果最佳，可达1.52个数量级，继续增加电场强度，杀菌效果提高不明显，这可能与果胶杆菌对电场强度的耐受程度有关。由图2B所示，果胶杆菌活菌对数减少值前期与脉冲占空比呈显著正相关（r=0.96，P＜0.05），当脉冲占空比为36.50%，杀菌效果可达1.60个数量级。不同脉冲占空比杀菌效果不同可能是因为细胞在高电平和低电平时的状态存在差异[16]，占空比为0%时，脉宽小，脉冲电场没有高电平部分作用于样品，杀菌效果差；脉宽过长，细胞已经适应高电平状态，继续提高占空比至42.6%和49.2%不会增加杀菌效果。另外，处理时间和脉冲频率与果胶杆菌的活菌对数减少值没有显著相关性（图2C、2D；P＞0.05），当处理时间达到1 min，脉冲频率达到200 Hz时，菌悬液中活菌对数减少值分别为1.66和1.57，但继续延长处理时间或提高脉冲频率，则对数减少值不再有显著变化（P＞0.05），即延长处理时间或提高脉冲频率均不会使果胶杆菌的数量明显下降。这与李楠楠[17]在使用不同脉冲频率高压脉冲电场处理金黄色葡萄球菌、大肠菌群、酵母菌和霉菌中的结果相似，推断果胶杆菌C-11对处理时间和脉冲频率不敏感可能与初始菌落数量及果胶杆菌自身特性有关。因此认为在本实验装置与条件下，电场强度和脉冲占空比是影响果胶杆菌杀灭效果的主要因素，后续试验将针对这两个因素展开研究。

图 2 不同电场强度（A）、脉冲占空比（B）、处理时间（C）和脉冲频率（D）对果胶杆菌杀灭效果的影响Fig.2 Effects of different electric field intensities (A), pulse duty factors (B), treatment time (C) and pulse frequencies (D) on the killing effect of Pectobacterium carotovorum

2.2 电场强度和脉冲占空比对果胶杆菌生长曲线的影响

生长曲线是反映微生物数量随时间变化的过程，从曲线中可以看出微生物对培养条件的适应情况，并反映其生长、繁殖和衰亡的规律。图3表明高压脉冲电场处理对果胶杆菌的生长有明显的抑制作用，且随着电场强度和脉冲占空比的增大，抑制作用逐渐增大。主要表现在延长了果胶杆菌生长的延滞期，与对照组相比，不同电场强度处理组果胶杆菌的延滞期延长了2～6 h（图3A），不同脉冲占空比处理组延滞期延长了2～4 h（图3B），生长速率明显受到抑制。这与王婷玉等[18]在大肠杆菌中的研究结果相似，即经高压脉冲电场处理后，大肠杆菌延滞期均有不同程度的增加，且其延滞期随着处理条件的增强而延长。相应地，处理组果胶杆菌对数期生长速率也有不同程度下降，到达稳定期的时间也相应延迟。因此，推断高压脉冲电场可以通过抑制果胶杆菌的生长，起到防腐保鲜的作用。

图 3 不同电场强度（A）和脉冲占空比（B）对果胶杆菌生长曲线的影响Fig.3 Effects of different electric field intensities (A) and pulse duty factors (B) on the growth curve of Pectobacterium carotovorum

2.3 电场强度和脉冲占空比对果胶杆菌细胞膜脂肪酸组成的影响

通过脂肪酸检测发现果胶杆菌C-11细胞膜的主要脂肪酸成分为月桂酸（C12:0）、豆蔻酸（C14:0）、棕榈酸（C16:0）、棕榈油酸（C16:1）和油酸（C18:1）。处理之前，总脂肪酸含量相对含量为95.69%，不饱和脂肪酸相对含量为60.42%。在不同电场强度处理后，不饱和脂肪酸含量逐渐下降（图4B）。当电场强度为28 kV/cm时，含量最低，仅为50.88%，与处理前相比下降了9.54%。而总脂肪酸相对含量在28 kV/cm之前也呈下降趋势，但下降幅度不高，主要是因为部分不饱和脂肪酸转化为了饱和脂肪酸。当电场强度为28 kV/cm时，不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸的比例为1.31，与处理前相比下降了27.22%。同样，提高脉冲占空比也使得不饱和脂肪酸含量显著下降（P＜0.05，图4D）。当占空比为36.5%时，不饱和脂肪酸含量最低，为50.21%，此时不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸的比例为1.25，与对照组（1.80）相比下降了30.56%。

图 4 不同电场强度和脉冲占空比对果胶杆菌总脂肪酸（A、C）和不饱和脂肪酸（B、D）相对含量的影响Fig.4 Effects of different electric field intensities and pulse duty factors on the relative amount of total (A, C) and unsaturated (B, D) fatty acid of Pectobacterium carotovorum

图 5 不同电场强度（A）和脉冲占空比（B）对果胶杆菌细胞膜渗透率的影响Fig.5 Effects of different electric field intensities (A) and pulse duty factors (B) on membrane permeability of Pectobacterium carotovorum

本研究的结果与高压脉冲电场处理酿酒酵母BY4742后总脂肪酸相对含量以及不饱和脂肪酸相对含量显著下降的结果一致[19]。此外，在脉冲电场处理的葡萄汁和花生油中也发现，总脂肪酸和不饱和脂肪酸含量有不同程度的下降[20-21]。这种对细胞膜结构的影响可能与高压脉冲电场处理引起的氢自由基产生有关[22]：氢自由基攻击不饱和脂肪酸与双键相邻的α-亚甲基氢原子后使不饱和脂肪酸按照自动氧化的链反应机制发生氧化反应，引起脂质过氧化反应，造成细胞膜结构及其功能的损伤。

2.4 电场强度和脉冲占空比对果胶杆菌细胞膜通透性的影响

当微生物细胞膜系统受到损伤时通透性会增加，造成细胞内离子外渗，因此常把细胞膜渗透率作为衡量细胞膜受损程度的重要指标[23]。如图5A所示，在不同电场强度处理下，除4 kV/cm处理组与对照组无显著性之外（P＞0.05），8、12、16、20、24、28、32和36 kV/cm的细胞膜渗透性均高于对照组，渗透率分别增加了0.38、0.58、0.73、1.15、1.42、1.85、1.81和1.80倍，与对照组均有显著性差异（P＜0.05）；由图5B可知，采用不同脉冲占空比处理时，所有处理组均与对照组有显著性差异（P＜0.05），6.5%、13.5%、20.5%、24.8%、30.9%、36.5%、42.6%、和49.2%处理组渗透率分别增加了0.80、2.45、3.56、4.86、8.92、11.82、11.88和11.68倍。综上，高压脉冲电场处理能增加细胞膜的渗透率，且随着电场强度和脉冲占空比的增大，对细胞膜渗透率的影响越大。当电场强度和脉冲占空比为28 kV/cm和36.5%时细胞膜渗透率达到最大值。这与该处理条件下果胶杆菌细胞膜不饱和脂肪酸相对含量以及不饱和脂肪酸/饱和脂肪酸比例达到最低值相一致，意味着在此条件下，对果胶杆菌细胞膜的结构和功能造成了损伤。

2.5 电场强度和脉冲占空比对果胶杆菌核酸和蛋白质泄漏量的影响

核酸和蛋白质是细胞重要的生命物质，其泄漏量可以反映细胞膜的受损伤程度。由图6可知，电场强度和脉冲占空比对蛋白质和核酸的泄漏量有显著性影响（P＜0.05）：当电场强度在4～16 kV/cm范围内变化时，胞内物质泄漏量较为缓慢，16 kV/cm以后泄漏量变化愈加明显（图6A）。当电场强度达到28 kV/cm时，核酸和蛋白质的泄漏量分别为对照组的1.50和2.00倍；同样，不管采用何种脉冲占空比，处理组与对照组相比核酸与蛋白质泄露量都显著增加（P＜0.05）。当脉冲占空比为36.5%时，核酸和蛋白质的泄漏量分别为对照组的1.60和2.02倍。以上结果表明，高压脉冲电场处理会使果胶杆菌细胞内核酸和蛋白质泄露，且随着电场强度和脉冲占空比的增大，相对泄漏量也逐渐增大。当电场强度和脉冲占空比为28 kV/cm和36.5%时核酸和蛋白质泄露最严重。因此后续在研究高压脉冲电场对不同生长阶段果胶杆菌存活率时电场强度和脉冲占空比最高设置到28 kV/cm和36.5%。

图 6 不同电场强度（A）和脉冲占空比（B）对果胶杆菌胞内核酸和蛋白质泄漏量的影响Fig.6 Effects of different electric field intensities (A) and pulse duty factors (B) on nucleic acid and protein leakage of Pectobacterium carotovorum

“电崩解”和“电穿孔”是目前高压脉冲电场杀菌机制中讨论较多的两种理论[24]。电崩解理论认为微生物的细胞膜在外加电场的作用下，发生可逆的细胞膜破裂，当长时间作用时，这种可逆的破裂就转化为了细胞膜大面积不可逆的崩解。电穿孔主要是由于外加电场导致微生物胞内物质泄漏，一些小分子如水进入细胞内，导致细胞吸水膨胀，微生物最终崩溃死亡[25-26]。因此常把细胞膜渗透率以及核酸和蛋白质泄漏量作为衡量细胞膜受损程度的重要指标[27]。HAMILTON等[15]发现当外加电场导致细胞的跨膜电位达到1 V左右时，细胞膜就会被击穿（这个值被称为击穿电位），胞内的离子、核酸和蛋白质类物质泄漏到胞外，导致细胞破裂死亡。电崩解可以看作是导致电穿孔的基础。在本实验中，高压脉冲电场处理增大了果胶杆菌的细胞膜渗透率，从而使胞内核酸和蛋白质泄漏，且随着电场强度和脉冲占空比的增大，细胞膜渗透率逐渐增大，细胞内容物泄漏量逐渐增加，最终导致细胞死亡。该研究结果与电崩解和电穿孔理论相一致。

2.6 高压脉冲电场对不同生长期果胶杆菌存活率的影响

从图3可知果胶杆菌的生长曲线可分为三段，0～5 h为延滞生长期，5～10 h为对数增长期，18 h以后进入稳定期。因此分别收集培养了5、10和18 h的果胶杆菌培养液，研究处于延滞期、对数期和稳定期的果胶杆菌对高压脉冲电场敏感程度的差异。由图7A可知，随着电场强度的增大，不同生长期果胶杆菌的存活率均呈下降趋势，且处于对数生长期的果胶杆菌存活率最低，其次是稳定期，延滞期的存活率最高。当电场强度在4～16 kV/cm范围时，对数生长期的果胶杆菌存活率显著低于其他两个生长阶段（P＜0.05）。说明果胶杆菌在对数生长期时对高压脉冲电场最敏感，其次是稳定期，在延滞期杀菌效果最差。此外，在不同脉冲占空比处理不同生长期果胶杆菌实验中也发现，对数生长期更为敏感（图7B）。该结果这与之前的一些研究结果相似。例如，ORTUNO等[28]用超临界CO2处理不同生长时期的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌时，发现对数生长期的微生物更为敏感；洪晨[29]则发现对数生长期的大肠杆菌对脉冲强光处理最敏感；而用脉冲磁场处理枯草芽孢杆菌时，对数生长期比稳定生长期和延滞生长期杀菌效果更好[30]。这可能是因为对数期的细菌正处于快速分裂期，细胞膜结构及胞内物质均不稳定，更容易受脉冲电场等外界刺激的影响。但严志明等[31]却发现大肠杆菌在平台期时的杀菌效果最差，在延滞生长期时的杀菌效果最好，这可能是由于菌种和培养环境不同，导致不同细菌的敏感区段有所差异。

图 7 果胶杆菌不同生长期对高压脉冲电场杀灭效果的影响Fig.7 Effects of different growth periods of Pectobacterium carotovorum on the killing effect of high pulsed electric field

2.7 存活率与各处理条件的动力学模型建立

2.7.1 电场强度及脉冲占空比对果胶杆菌的致死动力学方程 以Hülsheger提出的高压脉冲电场强度与微生物存活率关系一级动力学方程为参考[32]，假设微生物存活率S与电场强度或脉冲占空比呈一级动力学关系，以lnS为纵坐标，电场强度或脉冲占空比为横坐标进行作图。结果如图8所示，果胶杆菌对数减少值与电场强度和脉冲占空比的动力学方程分别为y=-0.1067x+0.1166和y=-0.0895x+0.3249，其相关系数则分别为0.9712和0.9445，表明不同电场强度和脉冲占空比对果胶杆菌的致死作用符合一级动力学模型。

2.7.2 存活率与电场强度及脉冲占空比的拟合曲线以存活率S为纵轴，电场强度或脉冲占空比为横轴，根据实验数据对果胶杆菌的存活曲线进行拟合，得到电场强度和脉冲占空比对果胶杆菌致死作用的拟合曲线。结果如图9所示：S电场强度=e-0.0923(x-0.444)、S脉冲占空比=e-0.0629(x-1.1276)。通过计算可知，杀灭果胶杆菌的临界电场强度为1.04 kV/cm，临界占空比为1.07%。对实际测量结果和拟合的预测值进行相关性分析和显著性分析，得到相关系数分别为0.993和0.999，平均相对误差率分别为19.00%和10.00%，说明了拟合曲线的准确性较好。电场之间关系的数学模型

图 8 不同电场强度（A）和脉冲占空比（B）下对果胶杆菌的致死动力学Fig.8 Lethal dynamics of Pectobacterium carotovorum under different electric field intensities (A) and pulse duty factors (B)

图 9 不同电场强度（A）和脉冲占空比（B）对果胶杆菌致死作用的拟合曲线Fig.9 Model curve of inactivation effects of different electric field intensities (A) and pulse duty factors (B) on Pectobacterium carotovorum

数学模型是评价高压脉冲电场杀菌效果的重要工具之一，对其实际应用具有理论指导意义[33]。HÜLSHEGER等[34]第一次提出建立微生物存活率对数与提出了微生物存活率和电场强度之间关系的Fermi方程通过大量研究数据积累，发现这些模型与实际数据之间有较好的拟合性，可以帮助食品从业者预测和控制食品的安全和货架期[36]。本研究运用Hülsheger模型拟合不同电场强度和脉冲占空比处理后果胶杆菌的存活率，得到的电场强度和脉冲占空比对果胶杆菌致死作用的拟合曲线方程分别为S电场强度=e-0.0923(x-0.444)、S脉冲占空比=e-0.0629(x-1.1276)，从该曲线可以看出，随着电场强度和脉冲占空比的增大，果胶杆菌的存活率逐渐下降。但是在整个过程中，微生物存活率的下降速率是不同：在初始阶段，果胶杆菌的存活率骤然下降，随着电场强度和脉冲占空比的增加，该过程变得缓慢，出现明显的拖尾现象。拟合曲线是杀菌效果随参数变化的直接体现，为选择合适的处理参数提供了依据。另外，回归系数可以反映微生物对该处理条件的敏感程度，回归系数越大代表敏感程度越高。本研究中电场强度和脉冲占空比对果胶杆菌致死作用的拟合曲线回归系数分别为0.0923和0.0629，说明电场强度对微生物影响更大。最后，决定系数代表了模型拟合度的优劣。本研究中两个动力学方程决定系数分别为0.9712和0.9445，说明该模型线性拟合较好，符合一级动力学模型。

3 结论

本文通过测定高压脉冲电场不同处理条件下果胶杆菌的存活率，明确了电场强度和脉冲占空比为影响杀菌效果的主要因素，且当电场强度为28 kV/cm，脉冲占空比为36.5%时，抑菌作用最强，果胶杆菌活菌对数减少值达1.60；同时发现在高压脉冲电场作用下，果胶杆菌延滞期延长，生长受到抑制，同时细胞膜中不饱和脂肪酸含量下降，结构被破坏，渗透性增大，胞内核酸和蛋白质发生严重泄漏。此外，不同生长期的果胶杆菌对高压脉冲电场敏感度不同，其中对数生长期最为敏感。最后建立了高压脉冲电场-果胶杆菌致死动力学模型，为实现高压脉冲电场的产业化应用提供数据支撑。此外，通过比较发现，本研究中高压脉冲电场处理对果胶杆菌C-11的杀菌效果与其他部分研究结果相比存在一定差距，推测可能与微生物种类或机器本身相关，后续可通过优化机器性能或者与其他杀菌方式协同处理提升杀菌效力。