阵发性睡眠性血红蛋白尿症的实验室检查

曾顺良 综述，曾 涛 审校

1.潮州卫生学校，广东潮州 521041；2.广东省惠州市第一人民医院检验科，广东惠州 516001

阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)是后天获得性干细胞疾病，是部分造血干细胞磷脂酰肌醇聚糖A(PIG-A)基因突变及其非恶性克隆所致。PIG-A基因突变的造血干细胞经克隆及多向分化，将缺陷经各系祖细胞依次传导至下游各阶段血细胞，使其性能改变而致PNH患者产生慢性(阵发性)血管内溶血、外周血细胞减少、血栓形成等各异的主要临床表现[1-3]。正常PIG-A基因表达的糖基转移酶是血细胞膜糖化磷脂酰肌醇(GPI)合成的关键酶[4]。异常PIG-A基因表达的蛋白，部分或全部不具有糖基转移酶功能，导致血细胞膜GPI合成障碍，使包括抑制补体溶细胞效应的同源抑制因子(衰变加速因子/CD55、膜反应性溶血抑制物/CD59)在内的一组GPI锚连蛋白，在血细胞外膜表现为部分缺失或全部缺失。CD55、CD59缺失程度决定PNH红细胞对补体溶细胞效应的灵敏度[5]，也是PNH红细胞分为正常敏感的Ⅰ型、中度敏感的Ⅱ型及高度敏感的Ⅲ型的依据[6]。高度敏感的Ⅲ型红细胞多寡是血管内溶血严重与否的关键因素。

PIG-A基因突变的造血干细胞克隆大小存在差别、异常克隆占比高低与正常克隆并存等，使不同患者或是同一患者在疾病不同阶段的表现各异，易致误诊、漏诊。随着发病机制研究的不断深入、实验室检查多种技术的联合应用，PNH的诊治得以进一步完善。本文就PNH实验室检查综述如下。

1 初筛性实验室检查

1.1外周血细胞及相关参数检查 多数PNH患者有不同程度的贫血，可呈正色素性贫血或低色素性贫血(尿液丢失铁过多时)；常伴有白细胞计数、血小板计数减低，网织红细胞常增高，但骨髓增生减低时，网织红细胞可减低。

1.2血管内溶血检查

1.2.1尿液检查 尿含铁血黄素检查又称Rous试验，用于定性筛查慢性血管内溶血。血管内溶血释放的血红蛋白通过肾脏滤过排出时，可被肾小管上皮细胞吸收、分解，并以含铁血黄素形式沉积于肾小管内，这种细胞经普鲁士蓝反应呈现即为Rous试验阳性。有研究发现，Rous试验的灵敏度可达73%[7]。慢性溶血发病初期，肾小管上皮细胞内含铁血黄素低于检测下限，或是含铁血黄素上皮细胞未脱落至尿液排出，Rous试验皆可呈阴性。此外，血管内溶血发作时，尿血红蛋白及潜血为阳性。因此，应注意PNH患者阵发性血管内溶血的特点，分时段多次采集尿标本检查其含铁血黄素、血红蛋白、潜血，以免漏检。

1.2.2生化检查 血管内溶血发作期内，外周血可出现游离血红蛋白、血清乳酸脱氢酶、间接胆红素水平等增高及结合珠蛋白水平降低。

1.3蔗糖溶血试验 依据PNH患者红细胞在含补体、低离子强度的高渗蔗糖溶液中发生渗透性溶血而设定。灵敏度较高、阴性可排除PNH，但特异性不强，易出现假阳性。部分自身免疫性溶血性贫血、巨幼细胞性贫血等可有假阳性[8]，阳性者必须通过酸化血清溶血试验或检测PNH克隆标志加以确证。

2 确证性实验室检查

2.1特异性补体溶血试验

2.1.1酸化血清溶血试验 酸化血清溶血试验又称Ham试验，基于PNH补体高敏感型红细胞于酸性、补体环境中易遭破坏的原理，特异度较高，但阳性率与PNH患者血液中Ⅲ型红细胞存量有关，且易受输注正常同型红细胞、实验前患者异常细胞破坏程度等的影响。何秋阳等[9]采用Ham试验检测40例PNH患者外周血的结果显示，阳性率为 65.0%，阴性率为35.0%；吴琼等[10]对7例经新型方法确证PNH患者的研究发现，2例为Ham试验阴性，应用该试验诊断PNH时，需要多次重复或辅以其他方法来确证，某些自身免疫性溶血性贫血患者Ham试验也可为阳性[8]。

2.1.2蛇毒因子溶血试验 蛇毒激活补体致PNH高度敏感的Ⅲ型红细胞溶解破坏，阳性率与Ham试验相近，也受输血、标本中异常细胞存量等的影响。

2.2新型确证试验

2.2.1CD55、CD59检测 CD55、CD59缺失是PNH细胞典型表现及PNH患者溶血的致病因素，故常将其作为PNH克隆的标志。随着流式细胞术和荧光标记单克隆抗体技术的发展，利用流式细胞仪检测外周血细胞CD55、CD59缺失用于PNH诊断、预后判断，成为目前临床上可靠、常用的方法[11-13]。

PNH造血干细胞多向分化，使PIG-A基因突变，除红细胞外还会累及粒细胞、单核细胞等。外周血白细胞不受输注正常红细胞的影响，白细胞尤其是占比最高的粒细胞锚连蛋白检测对于诊断PNH，比单独检测红细胞更有价值[10，14-15]，但外周血粒细胞检测CD55、CD59仍受骨髓衰竭致外周血细胞减少的影响。有研究指出，检测骨髓红系、粒系细胞的CD55、CD59比外周血更有意义[16]。PIG-A基因突变克隆的造血干细胞在骨髓中逐步分化发育，历经祖细胞、原始细胞、幼稚细胞、成熟细胞等及成熟阶段释放至外周血，不难看出，骨髓中出现血细胞CD55、CD59缺失早于外周血。故以CD55、CD59检测诊断PNH时，除开展外周血多种细胞组合检测外，还可检测骨髓红系、粒系细胞，以供早期诊断及避免漏诊，但目前仍缺乏检测骨髓CD55、CD59用以诊断PNH的定量标准。

2.2.2GPI锚连蛋白检测 (1)嗜水气单胞菌毒素(HEC)溶血试验。嗜水气单胞菌产生具有溶血、细胞毒性等生物活性的毒素，简称HEC，能特异性结合GPI锚连蛋白并与之形成异源多聚物膜通道致正常红细胞溶解破坏，留存GPI锚连蛋白缺失的PNH细胞，此研究为PNH确证试验的发展奠定了基础。有研究显示，国内学者应用HEC溶血试验与流式细胞术检测CD59缺失细胞进行比对，得出HEC溶血试验PNH细胞留存率与流式细胞术CD59缺失检测率一致的结论[17-18]。HEC溶血试验多为手工法，不需昂贵仪器，但尚无统一的方法流程及标准，且难以进行质量控制。(2)荧光标记气溶素(FLAER)技术。绿色荧光染料Alexa-488标记嗜水气单胞菌溶素前体变异体简称FLAER。FLAER能特异性标记血细胞GPI锚连蛋白，但不致血细胞溶解破坏，是近年来国内外用以佐证特异性补体溶血试验、CD59等缺失及诊断PNH的新技术。梁悦怡等[19]应用FLAER多参数与 CD59缺失对比检测9例PNH患者发现，FLAER检测结果明显高于CD59缺失检测，其中2例FLAER缺失率分别为88.1%、23.2%，而CD59缺失率仅分别为7.8%、5.5%。杨柯等[20]对22例PNH患者采用多参数流式细胞仪同时检测外周血粒细胞CD55缺失、CD59缺失和FLAER阴性细胞比例，作为检出PNH的克隆数,结果显示，FLAER技术检测FLAER阴性细胞的检出率及克隆数均依次高于CD55缺失、CD59缺失。FLAER技术比检测CD55、CD59更敏感[21-22]，对一些无血红蛋白尿、尿含铁血黄素等溶血证据、特异性补体溶血阴性、不能检出CD55及CD59缺失但临床上高度怀疑的病例，可用FLAER技术佐证或排除。

3 PNH实验室检查的建议

3.1鉴别 目前，实验室检查是诊断PNH的主要手段，基本流程为先初筛再确证。初筛性实验室检查结果并非PNH特有，应注意加以鉴别：多数白血病、恶性组织细胞病、再生障碍性贫血、巨幼细胞性贫血、脾功能亢进、骨髓增生异常综合征等可有外周血全血细胞(或一系、二系)减少的表现；内在缺陷或外在因素导致的急、慢性血管内溶血均有网织红细胞升高(骨髓衰竭除外)及上述生化指标异常、尿潜血阳性；自身免疫、药物等因素可引起慢性持续性血管内溶血而致Rous试验阳性。

3.2PNH确证方法的选择 我国制定的PNH诊断标准显示，血管内溶血检查如尿隐血、含铁血黄素试验等，传统特异性补体溶血试验如酸化血清溶血试验、蔗糖溶血试验、蛇毒因子溶血试验等，均是其诊断的重要方法[6]。PNH诊断标准还将外周血中性粒细胞或红细胞CD55缺失或CD59缺失>10%(5%～10%为可疑)作为确证试验。因此，应根据诊断需求、所在实验室的具体条件、相关试验的优缺点，选择适宜的PNH确证方法。就基层医疗卫生机构的实验室而言，不需要昂贵仪器和试剂，选择特异度较高的补体溶血试验，仍不失为较理想的初诊方法，需进一步确证分型时可将标本送至上级医院或第三方检验机构；对于三甲以上医院的实验室，则可在传统试验的基础上，联合应用CD55缺失、CD59缺失检测及FLAER技术，提高诊断的灵敏度。