隐球菌耐药机制研究进展

祁 傲，胡慧敏 综述,陈世平 审校

1.中国药科大学综合门诊部，江苏南京 210000； 2.南京医科大学第二附属医院微生物室，江苏南京 210000 ；3.南京医科大学第二附属医院呼吸与危重症医学科，江苏南京 210000

隐球菌是担子菌酵母类真菌，广泛分布于自然界，在鸽粪中大量存在，也可存在于人体表面、口腔和肠道中。隐球菌属包括17个种和8个变种，其中对人致病最主要的是新型隐球菌及其变种[1]。隐球菌病是由新型隐球菌引起的深部真菌病，主要侵犯中枢神经系统和肺，常发生于恶性肿瘤、白血病、淋巴瘤或应用大剂量糖皮质激素或化疗等免疫功能低下的患者[2]。2015年，FANG等[3]报道了我国免疫功能正常人群发生隐球菌感染的病例。隐球菌的毒力因子包括荚膜、黑色素、脲酶、磷脂酶、降解酶等。常见抗新型隐球菌感染的药物包括多烯类、唑类、核酸抑制剂类。近年来，隐球菌耐药问题日渐突出，成为其感染治疗失败的一个重要原因。氟康唑治疗过程中出现耐药可能与药物剂量不达标或治疗缺乏依从性有关[4]。临床上耐药菌株的产生通常是多种因素共同作用的结果[5]。本文对隐球菌耐药机制综述如下。

1 隐球菌的耐药机制

1.1生物膜的形成 生物膜是菌体适应外部环境、抵抗外界伤害所做出的反应，它是一种由融合的芽生孢子层、菌丝成分和细胞外多聚基质组成的二维结构[6]。形成生物膜的能力是新型隐球菌抗性的表现，膜内菌对药物、高温、寒冷、紫外线等更具抵抗性，生物膜形成可导致患者出现临床耐药并反复感染[6]。通常，新型隐球菌可在各种组织上形成生物膜并将自身包裹，阻止或延缓抗真菌药物进入细胞内，这些组织可以是活组织，也可以是无活力组织。细胞外多聚基质形成的生物屏障是菌株出现多重耐药的主要原因。有研究证实，有生物膜的菌株比浮游菌株对各种抗真菌药物有不同程度的抗药性，尤其是对唑类具有完全抗药性[7-8]。生物膜除了作为生物屏障防止药物进入菌体外，还可以通过限制营养的方式减缓菌体生长，从而避免因菌体活性过高被药物杀伤[9]。ROBERTSON等[10]研究表明，细胞外基质分泌的乙二胺四乙酸能阻止生物膜形成，这种阻止可以在加入二价阳离子(如镁、钙)后逆转，提示缺乏二价阳离子可抑制生物膜形成。这一发现可能成为隐球菌耐药病例治疗新的突破口。

1.2麦角固醇合成酶基因(ERG11)改变 麦角固醇由真菌合成，是真菌细胞膜的主要组分，也是唑类抗真菌药物的作用靶点。14-α-去甲氧基酶是合成麦角固醇的关键酶，该酶由ERG11编码。唑类药物通过黏附作用限制14-α-去甲氧基酶的活性，影响细胞膜形成而发挥抗真菌作用。ERG11改变包括基因高表达和基因突变，高表达意味着合成更多的14-α-去甲氧基酶，且需要更高的药物浓度来抑制该酶；基因突变导致药物对该酶的亲和力降低[11-12]，从而使耐药性增加。有学者通过分析某些耐药菌株ERG11的基因序列，发现一位点上甘氨酸484被丝氨酸替代，此为氟康唑耐药的突变位点，与氟康唑最低抑菌浓度提高密切相关[13]。

1.3药物外排增加 药物外排增加使细胞内药物浓度减少，从而产生对抗真菌药物的耐药性。药物外排增加可由菌株内多药物转运蛋白上调来实现。多药物转运蛋白包括ABC超家族转运蛋白和MFS超家族转运蛋白，前者在新型隐球菌中发挥主要作用。ABC转运蛋白有三大家族参与药物外排，分别是多药耐药家族、多药耐药相关蛋白家族、多效性耐药家族[14]。新型隐球菌中ABC转运蛋白由抗真菌药物耐药基因1(AFR1)编码，在耐唑类药物菌株中呈高表达[14]，提示AFR1上调与新型隐球菌的唑类抗性密切相关。有研究发现，ABC转运蛋白对两性霉素B、5-氟胞嘧啶、棘白菌素的灵敏度无明显作用[15]。

1.4基因组的可塑性 染色体重排、异染色体形成、非整倍体或二倍体形成均是基因组可塑性的体现，可以影响药物作用靶点或外排泵的表达，从而产生耐药。新型隐球菌分为A、B、C、D和AD 5个血清型[16]，SIONOV等[17]在血清型A和D的菌株中发现了染色体二倍体，这是新型隐球菌为了适应氟康唑而形成的。染色体二倍体数量越多，菌株耐受氟康唑的浓度越高，一旦停止用药后，二倍体数量减少，可使原本耐药菌株重新回到敏感水平。抗真菌药物可通过隐球菌凋亡诱导因子(AIF)诱发新型隐球菌类似细胞凋亡的细胞死亡，新型隐球菌可通过下调AIF表达而减少细胞凋亡。有研究发现，剔除AIF可促进染色体多倍体形成，从而对氟康唑产生耐药[18-19]。新型隐球菌耐药主要体现在1号染色体上，1号染色体的重塑与ERG11和AFR1 2个基因关系甚密，这种适应机制最终导致氟康唑治疗隐球菌病失败或者在维持治疗过程中复发。

1.5异质性耐药 异质性耐药的特点是在敏感菌株的单个菌落内出现高耐药水平的较小亚群，是真菌耐药的一种特殊类型。MONDON等[20]报道了新型隐球菌对氟康唑的异质性耐药现象，新型隐球菌对唑类的异质性耐药广泛存在，这种耐药是固有的，且与菌株的毒力有关，但耐药水平与其毒力水平不一定呈正相关[7]。新型隐球菌异质性耐药的出现通常与患者长期应用某种药物有关。药物长期作用导致新型隐球菌的染色体发生变异，从而引起其表型变化，体现在隐球菌生长模式、形态和毒力等方面，这可能是隐球菌病在治疗过程中即使抗真菌药物没有停用，疾病也会加重或复发的原因。当药物压力作用消失，这种耐药性也会随之消失，菌株可以恢复到原来的敏感水平[21]。有研究表明，异质性耐药主要出现在唑类单药治疗过程中，联合治疗可有效避免异质性耐药产生，如氟康唑联合5-氟胞嘧啶治疗可有效抑制体内耐药亚群扩增[22-23]，研究其异质性耐药水平有助于在长期维持治疗过程中合理使用氟康唑。

1.6真菌耐药性的表观遗传机制 表观遗传不是通过改变DNA序列或蛋白质编码，而是由DNA序列修饰以外的因素介导目标基因的表达[24]，这一作用是瞬间影响，主要有基于RNA和基于染色质修饰两种机制，与隐球菌密切相关的为基于染色质修饰。染色质修饰主要有两种：结构修饰和化学修饰。结构修饰指DNA-DNA相互作用和染色质重塑，化学修饰指烷基化、磷酸化、泛素化等。目前已知新型隐球菌中HDAC基因参与了染色质的去乙酰化过程，它被证实是可以调节菌株毒力和适应外界压力所需的基因[24]，一旦该基因缺失，将导致菌株毒力下降及对外界压力敏感[25]。

1.7应激反应通路的调节 微生物具有对抗外界各种压力刺激的能力，其中抗菌药物就是重要的外界压力刺激，这种能力通过复杂的应激反应通路实现。分子伴侣蛋白热休克蛋白90(HSP90)能维持各种酶的稳定性，是真菌对抗真菌药物应激反应通路中必不可少的关键蛋白，它通过钙调神经磷酸酶控制应激反应，包括耐药性。有研究显示，HSP90可以增加新型隐球菌对唑类和棘白菌素的抗性，抑制其表达能有效降低新型隐球菌的耐药性[26]。

1.8其他耐药基因的表达

1.8.1同源基因(PKH) 新型隐球菌PKH在其生物活动及隐球菌病发病机制信号传导中发挥重要作用。PKH又称磷酸肌醇激酶1，有PKH1、PKH2、PKH3 3种，PKH1和PKH2主要参与调节细胞生命功能，包括细胞RNA的新陈代谢、维持细胞壁的完整性及鞘脂生物合成等；PKH3主要参与新型隐球菌的抗性形成，包括其毒力、氧化应激及抗真菌药物[27]，尤其是对氟康唑和两性霉素B的耐药。此外，PKH2还与新型隐球菌抑制肿瘤坏死因子及产生氧自由基有关。总之，PKH参与调节了新型隐球菌的抗性。

1.8.2Kar2 Kar2是未折叠蛋白反应(UPR)通路下游重要的分子伴侣，参与UPR信号通路调控内质网蛋白质的各种活动。JUNG等[28]研究发现，缺乏Kar2的新型隐球菌因不能耐受应激、高热、抗真菌药物等外界压力而易出现死亡；相反，Kar2超表达则可有效解决错误蛋白质折叠，使毒性蛋白降解，维持细胞生存。由此可见，Kar2基因与新型隐球菌的适应性和抗性形成密不可分，在其生长过程中不可或缺。

2 小 结

隐球菌的耐药机制十分复杂，可以是一种也可以是多种机制并存。井然等[29]研究显示，我国目前新型隐球菌对伏立康唑全部敏感，但从2013开始就分离出了对氟康唑耐药的新型隐球菌菌株，且至今其耐药率逐年缓慢增加，由此提示全面认识隐球菌的耐药机制已刻不容缓。随着科学技术的发展及研究的进一步深入，将会有新的耐药机制被发现，了解这些耐药机制可以帮助临床医生从分子生物学角度更好地识别隐球菌，从而选择有效的抗真菌药物造福广大患者。