溃疡性结肠炎动物造模方法研究进展

郭莹，吴佳俊，环诚

（陕西中医药大学 医学技术学院，陕西 咸阳 712046）

0 引言

溃疡性结肠炎（UC）是炎症性肠道疾病（IBD）的一种亚型，结肠黏膜持续受免疫介导的炎症和溃疡。UC 在疾病的表型和治疗反应方面，表现出高度的异质性，使发病率和死亡率显著提高。常因血性腹泻、溃疡、肠道炎症、体重减轻和腹痛等症状，患者的生活质量被严重影响。[1-2]该疾病的确切发病机制尚不清楚，目前研究分析表明：宿主基因导致的遗传易感导致共生微生物的组成和结肠黏膜及上皮壁的完整性缺失[3-4]、肠道感染诱发原因：在人体血液或粪便中分别存在轮状病毒、肠道杆菌等病原体，这些致病菌导致肠道发生各类疾病[5]，人在预防或治疗其他疾病时，服用抗生素，导致机体肠道菌群失调，最终诱发UC。

细胞凋亡学说：细胞若大量发生凋亡，导致机体免疫系统受损，肠道黏膜处的重要稳定细胞中的上皮细胞，处于增殖和凋亡混乱状态，上皮细胞异常凋亡导致肠道黏膜屏障受损，最终诱发UC[6]，生活习惯等因素也是造成UC 产生的诱因之一：长期暴饮暴食，食用高胆固醇类多油高脂食物，增加胃肠负担，导致人体免疫力低下，从而诱发UC[7]，以上观点为UC 动物模型打下了坚实的理论基础。近年来我国UC 发病率有逐渐上升趋势[8]，长期反复地慢性肠炎有可能导致结肠癌的发生[9-10]，因此，建立UC 动物模型对于阐明UC 的病因和发病机制从而达到有效治愈的目的，具有重要的现实意义。

至今为止已有的UC 模型大致分为自发性模型、诱发性模型和基因修饰模型。运用各种方法建立的UC 模型也具有一定的趋向意义和研究意义。本文将从化学法、免疫法以及基因修饰模型法三方面就其原理、特点及应用评价进行综述，以期对UC动物模型建立提供思路。

1 化学法诱导的UC 模型

1.1 葡聚糖硫酸钠（Dextran sulfate sodium，DSS）诱导的UC 模型

DSS 具有抗止血和抗凝血功能的硫酸化多糖的聚合物。DSS 诱导产生的结肠炎机制尚且不明，有学者认为该模型可能为DSS 影响脱氧核糖核酸（DNA）合成[11]，从而抑制上皮细胞增生，使肠黏膜屏障遭到破坏，从而导致巨噬细胞功能障碍，最终导致固有层和黏膜下腔室暴露于肠腔内抗原和肠道细菌中，从而诱发产生免疫反应[12]。通过病理学观察发现该模型结肠腺损伤、糜烂、上皮增生和黏膜下水肿的组织学病变较显著[13]。

造模方法：DSS 造模方法可分为自由饮用和直肠灌注，通常实验室采用2%至5.5%浓度[14-18]的Dss 溶液进行造模，造模小鼠病理状态：总体特征为腹泻黏液便。肉眼血便，毛色暗淡，体重下降。DSS 诱导的 UC 组织病理学改变取决于小鼠饮用DSS 的时间。

特点：通过DSS 剂量可以调节DSS 的诱导成效，为控制疾病的范围方面提供经验，但该模型易受不同批次DSS 试剂、动物菌株、小鼠性别和局部微生物群的变异性的影响[19]。通过发现DSS 试剂浓度和给药时间的差异可以产生不同类型的结肠炎模型如：急性、慢性和复发性结肠炎[20]，其中慢性DSS 模型比较典型，应用C57BL/6 小鼠造模，急性给药DSS（饮水5 天）也可诱导慢性结肠炎，而BALB/c 小鼠却无法达到，在C57BL/6 中，在DSS暴露的5 天周期后4 周观察到组织病理学变化，如单核细胞浸润、不规则的上皮结构和胶原的持续沉积，而BALB/c 小鼠在同一时期内已经完全恢复[21]。由此可以得出不同品系小鼠对DSS 试剂的反应程度有所差异。该模型优点为操作简单、造模成功率高、可复制性好，与人类的UC 病变相类似，可作为一种理想的人类 UC 模型进行实验研究。DSS 模型被用于研究UC 病因和发病机制以及筛选对 UC有治疗具有潜力的天然药物和复方合成药剂[22]。

评价与应用：与人类UC 临床特点较吻合，既有慢性期，又有慢性病程的急性发作。用于研究人类UC 的急性期和缓解期的病理学表现特征[23]。

1.2 乙酸诱导的结肠炎

乙酸可以改变血管通透性，激活激肽，使纤维蛋白水解，从而诱发干扰凝血机制，此模型主要利用其毒性破坏结肠上皮细胞及其肠内细菌，最终毒素侵入肠道引起急性反应，该方法诱导出溃疡性结肠炎的短暂模型[24]。

造模方法：利用直肠灌注的方法，将浓度为0.9-1.4mol/L 的乙酸溶液[25-28]进行灌肠，注入直肠后让药物在直肠内停留10-30s，使溶液充分浸润结直肠段，该模型成功的关键在于乙酸浓度的配比。

特点：该模型的第一份报告由MacPherson 和Pfeiffer 提出[29]，他们向大鼠直肠滴注10%-50%的乙酸10 秒钟，然后用盐水冲洗管腔三次。在这些大鼠中观察到以乙酸剂量依赖性方式出现的弥漫性结肠炎，其组织病理学特征包括远端结肠溃疡和隐窝异常[30]溃疡和损伤的黏膜，其破坏有时延伸至淋巴结，在小鼠中几天内开始愈合，在大鼠中几周后开始愈合.[31]乙酸诱导的结肠炎的优点是其低成本和易于给药。

评价与应用：模型简单易行、成本低、周期短、重复性好、成功率高适用于研究人类UC 的急性期、炎症介质致炎机制及药物治疗机制，不适用于免疫机制的研究。

2 免疫法诱导的UC 模型

2.1 TNBS/DNBS+乙醇模型

三硝基苯磺酸（TNBS）/二硝基苯磺酸（DNBS）是一种半抗原模型，它通过直肠注入黏膜致敏剂DNBS/TNBS，在不同浓度的乙醇中稀释从而引起疾病。其中乙醇用于有效地打破肠道屏障，使半抗原与结肠组织蛋白相互作用。蛋白质与半抗原分子的偶联使这些蛋白质免疫原性，从而触发宿主的先天和适应性免疫反应[32]。虽然该模型需要时间较长，但一旦建立，该模型将导致对远端结肠的一致局部损伤。

造模方法：将小鼠禁食24h，自由饮水，造模前用乙醚进行麻醉，用直径为1mm 左右针管注入，将的TNBS 乙醇溶液注入直肠，将大鼠持续倒置至30s[33]。还有使用0.6mL 终浓度为33.3%的TNBS/无水乙醇混合溶液对小鼠进行灌肠处理[34]。

特点：在BALB/c 小鼠中，慢性TNBS 的特点是最初产生的是IL-12 和IFN ，但在TNBS 治疗第三周后，观察到IL-23 和IL-17 升高。在TNBS 治疗第五周后，观察IL-13 的产生，然后观察TGF 的分泌和纤维化的发展[35]。这些发现强调了从急性和慢性接触刺激的免疫进展。 因此，该模型中的治疗时间无疑将影响治疗效果，在组织病理学观察中发现，慢性TNBS 结肠炎的特点是弥漫性跨壁坏死，累及粘膜、黏膜下层和黏膜下水肿和明显的炎症浸润[36]。MPO 水平升高，提示中性粒细胞招募[35]。

2.2 噁唑酮模型

噁唑酮（4-乙氧基甲基-2-苯基噁唑-5-酮）是一种经典的触觉剂，历史上用于研究皮肤中的延迟型过敏反应，将半抗原噁唑酮和乙醇直肠内给药于小鼠动物导致急性结肠炎。

造模方法：将昆明小鼠暴露腹部皮肤涂抹l%OXZ(100%乙醇溶剂）0.2 mL 致敏重复进行2 天，5 天后将0.5%OXZ(50%乙醇溶剂）0.1 mL 缓慢注入小鼠肛门[37-38]。

特点：这种疾病的特征是T 辅助（Th）2 型免疫反应，白细胞介素（IL）-4 和IL-5 产生显著增加，伴有体重减轻、腹泻、溃疡和大肠上皮细胞丢失[39]。因此，它类似于溃疡性结肠炎，而不是其他IBD 亚型，使其与三硝基苯磺酸（TNBS）诱导的结肠炎（Th1 介导的免疫反应）不同，后者更接近于CD。自然杀伤T 细胞及其相关细胞因子，主要是IL-13，也与噁唑酮诱导的结肠炎诱导密切相关[40]许多研究利用噁唑酮诱导的结肠炎来测试溃疡性结肠炎的疾病病理学研究和治疗干预[41]。

3 溃疡性结肠炎的转基因和基因敲除动物模型

3.1 T 细胞转移模型

T 细胞转移模型是由T 细胞稳态被破坏所产生的慢性结肠炎模型[42]纯化CD4+CD34RB 的过继转移至幼稚的T 细胞进入同步宿主，缺乏T 细胞和B 细胞的小鼠，幼稚的T 细胞可以在腹腔内转移到受体小鼠[43]，在肠道抗原暴露的驱动下，幼稚T 细胞未经抑制的激活、分化和扩张最终导致结肠炎。调节性T 细胞与幼稚T 细胞一起转移可以抑制该疾病[42]。

特点：对该模型小鼠远端结肠的组织病理学检查揭示了UC 的许多特征，包括上皮细胞增生、多形核白细胞（PMN）和单核白细胞浸润、隐窝脓肿和上皮细胞侵蚀、硬膜外炎症，以及Th1 和/或Th17 细胞的发育，因此该模型通常被描述为适合于CD 治疗的评估[44]。该模型中的疾病已被证明依赖于IL-23 和IFN 介导产生，在药理抑制或遗传消融技术作用下，发现其中任意一种细胞因子都能抑制结肠炎的发生[45]。

4 结论

综上所述，随着科学技术的不断发展，越来越复杂的UC 动物模型出现，研究人员可以依照各种模型的优缺点和研究方向，合理选择动物模型去研究，就目前而言没有单一的结肠炎小鼠模型被证明可以预测UC 的临床特征与结果。因为许多因素可能导致小鼠与人类的脱节，包括生理学上的先天差异、慢性疾病与模拟慢性小鼠的生命时间、人类与近交系小鼠的疾病异质性以及药物和代孕物之间的药理学差异。由于基因修饰模型技术要求高喂养及繁殖条件严格，目前国内应用于UC 研究相对较少，但是基因修饰模型是有望今后有所突破的研究热点。化学法诱导的急性慢性模型，其成本低、可控程度较其他方法显著，虽然只能反应UC 的某些方面的特点，但依然是目前研究者使用最多的方法。