耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的耐药机制

邓裕祺 蔡燕

1.川北医学院医学检验系，四川 南充 637000；2.川北医学院附属医院，四川 南充 637000

1961 年，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）在英国被首次报道［1］，而抗生素的滥用导致了MRSA 多重耐药现象也日益严重，MRSA 对β-内酰胺类、四环素类、氨基糖苷类、大环内酯类、氟喹诺酮类和磺胺类等多种抗生素均能产生不同程度的耐药［2］。MRSA 已成为临床抗感染治疗的一大难题，因此，需进一步探究其耐药机制，为研发新的抗菌药物以及制定新的治疗策略提供参考。

1 MRSA 的流行病学特点

1959 年，甲氧西林作为治疗产β-内酰胺酶葡萄球菌的半合成青霉素开始投入临床使用，然而其进入临床不到1 年的时间就开始出现了耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌（MRSA），英国于1961 年首次报道了这些菌株；20 世纪60 年代中期，MRSA 逐渐蔓延至欧洲多个国家及加拿大；20 世纪80 年代以来，MRSA 在全球范围内急剧增多，已成为全球发生率最高的院内感染病原菌之一［1］。由于抗生素的滥用，MRSA 对β-内酰胺类抗生素等多种抗菌药物具有广泛的耐药性，万古霉素等糖肽类抗生素已成为目前治疗MRSA感染的“最后防线”。然而，1997 年在日本又发现了对万古霉素耐药的MRSA 临床分离株，此后其他国家也相继检测出中度耐万古霉素的金黄色葡萄球菌（VISA）或异质性中介耐万古霉素的金黄色葡萄球菌（hVISA）、完全耐万古霉的金黄色葡萄球菌（VRSA）［3］。MRSA 被认为是医院内感染最具代表性的病原菌，据报道，中国、韩国和日本的医院中MRSA 的检出率高达70%～80%［4］。MRSA 所致的感染不仅仅局限于医院内，社区获得性MRSA（CA-MRSA）的全球出现意味着MRSA 的流行病学已发生了改变［5］。

2 MRSA 的耐药机制

MRSA 的耐药机制相当复杂，主要通过葡萄球菌染色体盒mec（SCCmec）的可移动遗传元件介导，SCCmec携带的mecA 基因能大量表达与β-内酰胺类抗生素具有低亲和力的青霉素结合蛋白2a（PBP2a），其可代替正常青霉素结合蛋白合成细胞壁，从而产生耐药性，而MRSA 对万古霉素等糖肽类抗生素的耐药性主要由转座子Tnl546 编码的VanA 操纵子决定的。此外，MRSA还可以通过主动外排系统将抗生素等药物非选择性地泵出细胞，以降低其胞内的药物浓度，从而导致耐药。

2.1 青霉素结合蛋白 青霉素结合蛋白（PBPs）是参与细菌细胞壁肽聚糖生物合成的酶，具有转糖基化酶和转肽酶活性。β-内酰胺类抗生素的β 内酰胺环与DAla-D-Ala 肽聚糖支链具有相似的结构，可以与PBPs活性位点的丝氨酸共价结合，使PBPs 丧失正常的酶活性，从而干扰细胞壁合成［6］。在金黄色葡萄球菌（SA）中，存在四种天然的PBPs：PBP1、PBP2、PBP3 以及PBP4。PBP1、PBP2、PBP3 为细菌生长所必需的高分子蛋白，在细菌中含量少，可参与细菌细胞壁肽聚糖的合成，并且与β-内酰胺类抗菌药物具有高度的亲和性［7］。PBP1还在SA 的细胞周期中扮演着双重角色：既是分离所需的蛋白质，也是在细胞分裂结束时产生细胞分离关键信号的转肽酶。此外PBP2 还能为PBP2a 介导对MRSA的耐药性提供其缺乏的转糖基酶活性［8］。PBP4 是细菌生长非必需的低分子蛋白，在细菌中含量相对丰富，具有羧肽酶活性，与大部分β-内酰胺类抗菌药物亲和力低，但也有研究发现PBP4 可以在体内提供必要的转肽酶活性，并能对β-内酰胺类抗生素产生高水平的耐药性。PBP4 也是CA-MRSA 产生耐药性的重要因素［7，9］。

除此之外，MRSA 还存在一种由mecA 基因编码的特殊的PBPs，即PBP2a，该蛋白是MRSA 对β-内酰胺类抗生素产生广泛耐药的基础。PBP2a 是一个结构细长的蛋白，包含转肽酶区、跨膜区和具有变构位点的非青霉素结合区。正常的PBPs 与β-内酰胺类抗菌药物的结合能力强，而PBP2a 的活性部位位于狭窄而又相对封闭的空间，很难与β-内酰胺类抗菌药物结合，使其肽聚糖的合成作用能够得到充分发挥，代替正常PBPs 功能合成细胞壁，从而对于β-内酰胺类抗生素产生耐药［10］。PBP2a 的另一个重要结构特征是其受变构控制。新生的肽聚糖与位于非青霉素结合区的变构位点结合后，启动了打开活性位点的构象变化以协助底物结合［11］。变构位点可以作为新开发的药物靶点，因为它的功能对细胞壁生物合成的催化至关重要。

2.2 耐药基因

2.2.1 mecA 基因。如上文所述，mecA 基因可编码产生与β-内酰胺类抗菌药物低亲和力的PBP2a，使MRSA获得耐药性。mecA 基因由可移动的遗传原件SCCmec携带，它的表达主要受mecR1-mecI 及blaR1-mecI 系统调控。mecR1 和mecI 是转录调节基因，其中mecR1编码诱导蛋白MecR1，mecI 编码阻遏蛋白MecI。在没有使用抗生素的情况下，mecI 编码的阻遏蛋白MecI结合在mecA 基因的启动子部位，从而抑制mecA 的表达。当使用β-内酰胺类抗菌药物后，可以通过青霉素结合区域感受到抗菌药物的存在，抗菌药物与诱导蛋白MecR1 结合，导致信号跨膜转导，MecR1 被激活；活化的诱导蛋白MecR1 诱导胞内感受器区域自动裂解，导致阻遏蛋白MecI 分解，从而去除了MecI 对mecA 基因的抑制作用，启动mecA 基因表达，产生大量的PBP2a。blaR1-blaI 系统与mecR1-mecI 系统的调控机制相似，blaR1 编码诱导蛋白BlaR1，blaI 编码阻遏蛋白BlaI，在β-内酰胺类抗菌药物存在时，诱导蛋白BlaR1 被激活，水解阻遏蛋白BlaI，阻碍BlaI 蛋白与mecA 基因启动子结合，使mecA 基因表达，产生PBP2a［12-13］。研究显示，除了mecR1-mecI 外，在mecI 基因的下游还存在基因mecR2，mecR2 的功能是充分诱导mecA 表达，补偿mecR1 对mecA 的无效诱导［14］。

mecA 基因是一个外源基因，可能来自凝固酶阴性葡萄球菌，但MRSA 中mecA 基因的确切起源和进化目前仍然存在争议，早前认为松鼠葡萄球菌的mecA基因可能是其进化前体，后来又有研究提出福氏葡萄球菌可能是MRSA 中mecA 基因的进化起源［15］。mecA基因不是金黄色葡萄球菌所特有的，在耐甲氧西林的表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、假中间葡萄球菌、中间葡萄球菌等其他葡萄球菌中也有报道［10］。

2.2.2 mecC 基因。2007 年，英国对牛乳腺炎进行流行病学调查时，从牛奶样本中发现了mecA 阴性的金黄色葡萄球菌LGA251，后来对该菌株进行了全基因组测序并分析其结果，发现该菌株携带有一种新的耐药基因mecALGA251，该耐药基因与mecA 在DNA 水平上具有69%的同源性［16］，在2012 年被重新命名为mecC 基因。

Kim C 等［17］的研究证明了mecC 编码的PBP2a 的功能及其在β-内酰胺抗生素耐药性中的作用，mecC基因也存在于SCCmec 内，也可编码产生PBP2a，但是与mecA 基因所编码的蛋白有所不同。mecC 在编码PBP2a 时也会受到mecI/mecR 的调控，mecC 所编码的PBP2a 对苯唑西林的亲和力高于对头孢西丁的亲和力，而mecA 编码的PBP2a 对头孢西丁的耐药性高于苯唑西林。并且，这两种蛋白在热稳定性和最适温度上也表现出差异，在37℃时，mecC 编码的PBP2amecC 比mecA 编码的PBP2amecA 表现得更加不稳定。另外，PBP2amecA 介导的高水平苯唑西林抗性需要固有PBPs 的参与来提供所缺乏的转糖基酶活性，而PBP2amecC 则不需要，这可能是因为mecC 与其他单功能的糖基转移酶协同发挥作用［18］。

虽然mecA 和mecC 编码的蛋白具有不同的生化性质，但mecC 仍然具有甲氧西林耐药性，mecCMRSA是最近认可的MRSA 的一种形式，尽管mecCMRSA 目前在人类中并不常见，但mecCMRSA 可以在物种间传播，与动物接触会带来人畜共患的风险，并且由于抗生素的使用和随之产生的选择压力更有可能会推动进化的飞跃，从而导致其急剧传播［19］。因此，从实验室诊断的角度出发，正确的鉴定这些菌株非常必要。使用药敏试验来检测MRSA 时，mecCMRSA 对苯唑西林和头孢西丁的最小抑菌浓度（MIC）通常低于mecAMRSA；而在使用传统的分子学方法来鉴定MRSA 时可能导致假阴性结果［20］。所以需要考虑采用能同时扩增mecA和mecC 的通用mec 基因引物进行PCR 检测，或者添加mecC 特异性引物来区分mecAMRSA 和mecCMRSA。

2.2.3 mecB、mecD 基因。2018 年，在对金黄色葡萄球菌的筛查中发现了一株mecA 和mecC 基因阴性，但仍然对甲氧西林耐药的菌株。该分离株携带一种mecB基因，通过对其基因序列的比较发现该基因与早期已报道的溶酪大球菌的mecB 基因有100%同源性，与原始的mecA 有60%的相似性。该基因的侧面有类似于mecI、mecR 和blaZ 的调控基因。与mecA 和mecC 相似，mecB 基因也会产生甲氧西林耐药性，因此携带mecB基因的菌株应鉴定为MRSA 而不是MSSA［21］。

2017 年，Schwendener S 等［22］报道了牛和犬来源的耐甲氧西林溶酪大球菌中携带一种新的mecD 基因。mecD 基因与mecB 基因在核苷酸水平上有66%的同源性，与原始的mecA 的序列同源性为61%。该基因对包括头孢菌素在内的所有β 内酰胺类抗生素都具有耐药性，转移到金黄色葡萄球菌可能会危及最后一代头孢菌素在MRSA 治疗中的作用。mecD 基因位于基因组岛McRImecD-1 和McRI-mecD-2 上，这两个岛都整合在RPSI 基因的3’端。在金黄色葡萄球菌中检测到类似的RPSI 相关整合酶，表明新的甲氧西林耐药基因mecD 有可能在宿主范围内广泛传播。

2.2.4 辅助基因（fem 基因簇）。研究发现，MRSA 耐药水平的高低与mecA 基因的表达水平及PBP2a 的产量无关，据此推测可能还存在其他因素参与了高水平甲氧西林耐药的表达。后来，在SA 中发现还有一些特别的基因也参与MRSA 耐药性的产生，这些基因被命名为fem［23］。这些基因直接或间接地参与细菌细胞壁的生物合成，在甲氧西林耐药性表达中也起着非常重要的作用，当fem 基因失活后，菌株可由高耐药变为低耐药。因此，fem 基因簇也可能成为逆转MRSA 耐药性的潜在药物靶位。目前已知的fem 基因簇大约30 个，包括femA、femB、femX、femC、femD、femE、femF、llm、sigB、pbp2 等，其中大多数是管家基因。femX、femA 和femB分别编码蛋白FemX、FemA 和FemB，分别将第1，第2、3 以及第4、5 个甘氨酸添加到五甘氨酸肽间桥，从而参与细胞壁肽聚糖的合成。当femA 和femB 失活时，五甘氨酸被单甘氨酸取代，使细胞壁肽聚糖成分发生改变，使MRSA 对抗生素的耐药水平明显下降，但PBP2a 的产生不受影响［23-24］。当femC 失活时，谷氨酰胺合成酶编码基因（glnA）的转录减少，使谷氨酰胺合成受阻，从而降低细菌的耐药水平。另外，femC 灭活后导致异谷氨酰胺的酰胺化作用降低，减少了粘肽的交联，从而导致甲氧西林耐药性的降低，但并不影响异质耐药性的表达。femD 编码磷酸葡萄糖胺变位酶，催化葡萄糖-6-磷酸与葡萄糖-1-磷酸的相互转化，后者是UDP-N 乙酰葡萄糖胺的前体物质，femD 失活会影响肽聚糖前体物质的合成，使基础耐药水平降低，但可形成高度耐药的亚克隆。femF 失活会导致在肽聚糖前体物质合成过程中赖氨酸添加受阻，从而使细菌耐药性降低，也能导致异质性耐药表达［25］。

2.2.5 vanA 操纵子。MRSA 对万古霉素的完全耐药性是由转座子Tnl546 编码的VanA 操纵子赋予的，VRSA可以通过保留获得的原始肠球菌质粒或将万古霉素耐药肠球菌（VRE）质粒中的Tnl546 转座到葡萄球菌质粒中来维持耐药性［26］。万古霉素通过与细胞壁肽聚糖前体D-Ala-D-Ala 形成非共价氢键，阻止其用于细胞壁合成从而发挥抗菌作用。VanA 操纵子介导的万古霉素耐药机制主要是通过水解与万古霉素结合的DAla-D-Ala 肽聚糖前体，以及将末端二肽修饰成不能与万古霉素结合的D-Ala-D-Lac 而产生抗药性［27］。

VanA 操纵子由VanA、VanH、VanX、VanS、VanR、VanY 以及VanZ 基因组成，这些基因所编码的相应的几种酶共同作用赋予了细菌对万古霉素的抗性。VanA操纵子通过由VanS 和VanR 编码的双组分调控系统控制的，该系统由传感器激酶蛋白VanS 和应答调节蛋白VanR 构成，可以识别万古霉素并激活操纵子的转录。VanA、VanH 和VanX 共同作用对万古霉素耐药表型至关重要；VanX 可以水解D-Ala-D-Ala 为D-Ala单体，VanH 通过水解丙酮酸生成D-Lac，VanA 能够催化D-Ala 和D-Lac 之间合成一个肽键，生成D-Ala-DLac；万古霉素不能识别D-Ala-D-Lac，肽聚糖则可以相互连接，最终合成一个改变但完整的细胞壁。VanY与细胞膜结合，可以切断五肽结构C 端的D-Ala 残基，有助于D-Ala-D-Ala 的水解，但没有转肽酶或内酰胺酶活性。而VanZ 的作用目前尚不清楚，其可能使SA 对替考拉宁产生耐药性［26-27］。

2.3 葡萄球菌染色体mec 盒（SCCmec） 葡萄球菌染色体盒式结构mec（SCCmec）通过SCCmec 的转移将MSSA转变为MRSA，同时可捕获外来DNA 片段加以整合，使菌株获得复杂的耐药性。SCCmec 元件都具有以下共同的结构特征：mec 基因复合体、ccr 基因复合体、三个J（junkyard）区。其中，mec 基因复合体与MRSA耐药表型相关，包含mec 基因（mecA、mecB、mecC、mecD）及其调控元件（mecR1，mecI）和相关的插入序列；根据mec 基因上下游的调控元件和插入序列的不同，将mec 基因复合体分为5 类：即A-E 类。ccr 基因复合体也叫盒式染色体重组酶基因复合体，由ccr 基因（ccrA、ccrB、ccrC）及其周围的开放阅读框（ORF）构成，负责SCCmec 的重组和转移；根据ccrAB 及ccrC 的不同，ccr基因复合体可分为9 种类型：1（A1B1）、2（A2B2）、3（A3B3）、4（A4B4）、5（C1）、6（A5B3）、7（A1B6）、8（A1B3）、9（C2）；在ccr 基因复合体中，通过ccrAB 或/和ccrC 的位点特异性重组，可以在SCCmec中插入抗生素耐药基因和重金属抗性基因，并且，还可以通过ccrAB 或/和ccrC 的精确切割和整合，使得SCCmec 被整合到葡萄球菌的染色体上。此外，SCCmec 元件还含有3 个J区（J1、J2、J3），这些组件可能携带其他的抗生素耐药性决定簇；其中，J1 区通常包含几个ORF 和调节基因，J2区包含整合酶基因或转座子T554 等遗传元件，J3 区通常具有编码抗生素耐药性的质粒，包括质粒pT181（编码四环素耐药性）、pUB110（编码氨基糖苷耐药性）等［10，28-29］。

目前SCCmec 根据mec 和ccr 基因复合体的性质被分为Ⅰ-ⅩⅢ类。其中Ⅰ-Ⅴ是主要类型，Ⅰ-Ⅲ型SCCmec元件较大，都主要发现于医院获得MRSA（HA-MRSA）菌株中，而SCCmecⅣ-Ⅴ元件较小，更多地分布于社区获得性MRSA（CA-MRSA）中。SCCmecⅠ型在J1 区携带一个B 类mec 基因复合体、一个1 型ccr 基因复合体和一个pls 调节子；SCCmecⅠ型携带耐药基因较少，因而仅对β-内酰胺类抗菌药物耐药。SCCmecⅡ型携带A 类mec 基因复合体、2 型ccr 基因复合体、J3 区葡萄球菌质粒pUB110 的整合拷贝和J1 区的KDP 调节子；除携带β-内酰胺类抗生素耐药基因外，SCCmecII型还存在携带氨基糖苷类抗性的pUB110 质粒和携带红霉素、大观霉素抗性的Tn554 转座子。SCCmecⅢ型携带A 类mec 基因复合体、3 型ccr 基因复合体以及质粒pT181 的整合拷贝；SCCmecⅢ型比SCCmecⅠ、Ⅱ型携带更多的耐药基因，包括在J2 区编码镉抗性的转座子ΨTn554，在J3 区编码四环素抗性的质粒pT181 以及编码红霉素和大观霉素抗性的转座子Tn554［30］。

SCCmecⅣ型是迄今为止最小的、具有B 类mec 基因复合体和2 型ccr 基因复合体的组合，并在J3 区携带转座子Tn4001；SCCmecⅤ型含有C2 类mec 基因复合体和5 型ccr 基因复合体；由于SCCmecⅣ和Ⅴ型其遗传结构简单，除mecA 外，在SCCmecⅣ和Ⅴ型中未发现任何抗生素抗性基因［29-30］。从耐药表型上看，SCCmecⅠ、Ⅳ、Ⅴ型通常只对β-内酰胺类抗菌药物耐药，而SCCmecⅡ型和SCCmecIII 型含有多种耐药基因的质粒或转座子，因而可以呈现多重耐药的特性。

SCCmec 是一种携带抗生素耐药基因和位点特异性重组酶基因的移动遗传元件，在MRSA 的耐药性、进化和分子流行病学中起着重要作用。以干扰或阻断SCCmec 转移或促进其切除为导向，将MRSA 逆转为MSSA，可为新药的研发提供新的思路。

2.4 主动外排系统 主动外排泵是细菌细胞膜上存在的一种膜转运蛋白，是由相关外排基因表达产生的，能将抗生素、灭菌剂和有毒金属等物质非选择性地泵出细胞外，使细菌胞内药物浓度降低而导致细菌耐药。许多研究表明在MRSA 中外排泵的过度表达的频率很高，说明外排泵可能与MRSA 的多重耐药有关［31］。在SA 中发现的多药外排泵主要分为5 个膜蛋白家族：主要易化子超家族（MFS）、小多重耐药家族（SMR）、多药及毒性化合物外排家族（MATE）、ATP 结合盒超家族（ABC）、耐药结节细胞分化家族（RND）。这些外排泵按能量依赖形式分为主要转运蛋白和次级转运蛋白。主要转运蛋白中药物运输的能量由ATP 水解提供，如ABC 转运蛋白家族；而次级转运蛋白利用离子/电化学梯度（通常是质子驱动力（PMF））来将药物排出细胞外，如MFS、SMR、RND 和MATE 转运蛋白［32］。MFS 是SA 中研究最多的，包括NorA、NorB、NorC、MdeA、SdrM、QacA/B 等外排蛋白。分析显示，NorA、NorB 在亚洲和美洲最常见，NorB、MdeA 在欧洲最常见；在我国，90%以上的MRSA 分离株NorA、NorB、NorC、MdeA 和SdrM均呈阳性［33］。NorA 是最早发现的MRSA 耐氟喹诺酮类药物的主动外排机制；而NorB 基因的过度表达可导致细菌对氟喹诺酮类药物、四环素甚至消毒剂和染料产生抗药性［34］；此后又有研究表明MRSA 对消毒剂和阿米卡星等抗生素产生的耐药性与外排泵QacA/B 有关［35］。外排泵的另一个可能的功能是输出毒力因素，如与致病性相关的黏附素、毒素和群体感应分子。现已证明ABC 家族的ABCA 蛋白能够分泌金黄色葡萄球菌溶细胞毒素［36］。

外排泵抑制剂是对抗MRSA 多重耐药的合理策略，虽然在SA 中发现了新的NorA 活性抑制物质，但由于毒性等多种原因，到目前为止还没有一种外排泵抑制剂进入临床试验。因此，还需更深入地研究，以助于研发新的抗菌药物。

3 小结

MRSA 作为医院和社区获得性感染的重要病原菌之一，已成为临床治疗的一大难题。进一步深入研究MRSA 的各种耐药机制，有利于研发新的抗菌药物及制定新的治疗策略。此外，通过对其耐药机制的研究，使我们更全面、正确地认识MRSA，从而改进和完善MRSA 的实验室检测方法，以更好地指导临床用药，预防和控制MRSA 感染。