葡萄胎免疫学研究进展

朱国华，杜美蓉，鹿欣

葡萄胎（hydatidiform mole）属于妊娠滋养细胞疾病（gestational trophoblastic disease，GTD），是与妊娠相关、来自胎盘滋养细胞异常增生的良性疾病。葡萄胎包括完全性葡萄胎（complete hydatidiform mole，CHM）、部分性葡萄胎（partial hydatidiform mole，PHM）两种类别。另外，约5%PHM 及20%CHM 可进展为妊娠滋养细胞肿瘤（gestational trophoblastic neoplasia，GTN），约占GTN 来源的50%～60%[1-2]。正常妊娠时，妊娠滋养细胞分泌细胞因子招募、诱导免疫细胞富集于母胎局部[3]，同时滋养细胞分泌人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，hCG）诱导卵巢黄体酮持续分泌，继而母体全身免疫状态随之发生改变。据报道妊娠后孕酮促进外周血自然杀伤（natural killer，NK）细胞表面T 细胞免疫球蛋白黏蛋白3（T-cell immunoglobulin mucin-3，Tim-3）表达升高，而Tim-3 是抑制性信号分子之一[4]。葡萄胎的病理进程类似于正常妊娠，但其以父系印迹基因主导的胚外滋养细胞过度增生为主要特点。目前，葡萄胎患者免疫系统如何改变尚无明确统一的观点。

1 葡萄胎的分类及其依据

如前所述，葡萄胎分为CHM 和PHM。CHM 是更常见的类型，其妊娠物中不具有胎儿成分，而在PHM 的妊娠物中则存在变形的、不能存活的胎儿成分。就遗传物质组成而言，CHM 通常是二倍体，PHM则通常为三倍体[5]。在CHM 中，90%核型为46,XX，10%核型为46,XY。即一个去核卵被两个精子或一个单倍体精子受精后再复制，因此CHM 只有父系DNA被表达[6]。在PHM 中，90%核型为三倍体，为69,XXX或69,XXY。即精子使单倍体卵重复受精或两个精子使单倍体卵受精时，则出现这种核型。在PHM 中，父系和母系DNA 都被表达[5]。

因此，不论是CHM 或是PHM，过度表达的父源印迹基因是导致滋养细胞过度增生的遗传学基础。而母系染色体有或无的表达，则决定其呈现为CHM或PHM 的表型。就CHM 而言，对母体来说，妊娠物中全部遗传物质均属于非己来源，其几乎等同于同种异体移植物。但CHM 却相较于PHM 更不易被机体清除，且在清宫术后，更易进展为GTN[7]，其中的免疫学机制值得探究。

2 正常妊娠中滋养细胞免疫学行为

正常妊娠时，单倍体精子与单倍体卵子结合发生受精反应，形成二倍体受精卵。接着其在输卵管逐渐发育分化，移行至子宫，着床时已被覆滋养细胞，由滋养细胞作为胚胎与子宫内膜接触、交流的屏障[8]。正常妊娠的胎儿成分因其遗传物质组成常被类比为半同种异体移植物，但其滋养细胞并不表达Ⅰ类主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）分子人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA），而表达非经典Ⅰ类MHC 分子，如HLA-E、HLA-G，且主要表达在绒毛外滋养细胞（extravillous trophoblast cells，EVT）中[9]。已有研究显示，滋养细胞具有诱导母体面免疫细胞聚集、分化及耗竭的独特免疫学功能[3]。滋养细胞通过趋化因子CXC 模体配体12（CX-C motif ligand 12，CXCL12）/CXC 模体受体4（CX-C motif receptor 4，CXCR4）轴优先募集CD25+NK细胞，并训导为蜕膜自然杀伤（decidual natural killer，dNK）细胞[10]；滋养细胞还可分泌趋化因子CXCL16诱导M2 型巨噬细胞极化，进一步减少白细胞介素15（interleukin-15，IL-15）分泌，使NK 细胞失活[11]。

在妊娠早期，dNK 细胞比例可高达70%，巨噬细胞比例约为20%，T 细胞比例约为10%～20%，其余免疫细胞如树突状细胞、B 细胞相对较少[12]。这些免疫细胞在胎盘发生、发展过程中发挥不同功能。尽管同为滋养细胞，葡萄胎滋养细胞却不能引起相似的免疫学改变。

3 葡萄胎免疫学进展

早期葡萄胎的免疫学研究集中在描述其滋养细胞的免疫原性及其诱导免疫耐受能力，比如发现葡萄胎滋养细胞表达经典MHC 分子，组织囊泡液具有抑制免疫细胞增殖的能力[13-15]。进入21 世纪之后，相关研究集中于母胎界面的免疫细胞分布及表型，重点关注葡萄胎所引起的母体变化，探讨母体免疫环境改变与葡萄胎预后的关系。

3.1 葡萄胎患者母胎界面具有复杂的免疫学调控网络免疫细胞是包括NK 细胞、T 细胞和巨噬细胞等多种具有不同生物学功能的髓系来源细胞的总称。不同功能的免疫细胞表型、数量及比例代表着局部不同的免疫反应。免疫组织化学技术是回顾性研究葡萄胎患者母胎界面免疫细胞组成的重要手段。21 世纪初，研究人员利用该技术发现CHM 患者蜕膜免疫细胞总数明显高于正常妊娠女性[16-18]。细胞毒性T 细胞（cytotoxic T cell，Tc 细胞）增多，CD56+NK 细胞比例相对减少是葡萄胎母胎界面免疫的重要特征[17]。CHM 蜕膜植入部位中颗粒酶B 阳性的Tc 细胞和NK 细胞浸润明显高于正常妊娠蜕膜，且Tc 细胞浸润与调节性T 细胞（regulatory T cell，Treg 细胞）浸润呈正相关[18]。尽管研究揭示了葡萄胎能够诱导母体面具有细胞毒性的免疫细胞聚集，但仍不能解释约25%的葡萄胎进展为GTN 的原因。

近年来研究发现，在术后需要化疗的CHM 中，其巨噬细胞表面受体结合癌抗原1、HLA-G 及含V-set 结构域T 细胞激活抑制因子1（V-set domain containing T cell activation inhibitor 1，VTCN1）的表达明显更高[18]。HLA-G 是非经典Ⅰ类MHC 分子，也被认为是免疫检查点分子[19]，主要表达在正常妊娠时的EVT、葡萄胎及滋养细胞肿瘤的中间滋养细胞[9,20-21]。正常妊娠时，EVT 表达的HLA-G 可通过免疫球蛋白样转录本2（Ig-like transcript 2，ILT2）、ILT4 和杀伤性免疫球蛋白样受体2DL4（killer immunoglobulin-like receptor 2DL4，KIR2DL4）调节免疫细胞[22]。其中KIR2DL4 的表达可明显抑制dNK细胞对HLA-G+细胞杀伤毒性，复发性流产患者中可观察到的KIR2DL4 表达下调，进一步强调HLA-G/KIR2DL4 通路可明显抑制dNK 细胞毒性以逃避免疫杀伤。此外，表达HLA-G 的细胞外囊泡还可以在局部诱导形成免疫耐受微环境[23]。提示HLA-G 在抑制母体免疫细胞毒性、避免免疫杀伤及维持胎儿正常发育中发挥重要作用。然而在滋养细胞肿瘤中的研究发现，HLA-G 在绒毛膜癌单药化疗耐药组的表达明显下调，并且可作为预测绒毛膜癌单药化疗耐药的生物标志物[24]。尽管不能排除表达HLA-G 的细胞具有更高的化疗敏感性的可能，其也提示绒毛膜癌的HLA-G 表达具有某些特性。HLA-G 在葡萄胎滋养细胞中也有表达，但尚无其是否参与葡萄胎诱导母体免疫耐受的文献报道。

相对于妊娠早期的正常绒毛，CHM 胎盘滋养细胞表现出明显的免疫相关通路失调。基于高维全转录组数据的结果表明，CHM 胎盘滋养细胞具有较低胎盘特异性基因表达水平以及相对较高的免疫相关基因表达丰度，MHC Ⅰ类分子及Ⅱ类分子显著上调；富集分析显示约有17 条免疫相关通路失调，其中细胞因子-细胞因子受体相互作用通路最为显著[25]。胎盘特异性基因表达的缺失揭示CHM 滋养细胞存在分化缺陷，免疫相关通路的失调表明CHM 滋养细胞在母胎界面局部发生了复杂的免疫调控事件，但葡萄胎滋养细胞是被动响应机体免疫反应而作出的受调控反应，还是主动调控部分细胞因子表达以调控母体免疫细胞还需要体外实验验证。

多重免疫组织化学技术是近年来新发展的可基于石蜡标本的多重免疫荧光染色的实验技术[26]。Hoeijmakers 等[27]通过该技术对CHM 的蜕膜组织石蜡样本实现涵盖CD45RO、CD3、CD8、Foxp3、CD56及泛角蛋白等多分子共同染色，以分析CHM 蜕膜免疫细胞组成及其与预后的关系，研究发现自发缓解的CHM 患者CD3+CD56+蜕膜自然杀伤T（natural killer T，NKT）细胞浸润明显高于疾病进展组，且浸润程度低与良好预后有关。NKT 细胞与机体免疫的关系具体取决于其具体亚型：Ⅰ型NKT 细胞可促进抗肿瘤免疫，而Ⅱ型NKT 细胞抑制抗肿瘤免疫[28]。由于样本及技术限制，该研究未进一步探究其具体亚型。CD56+NK 细胞仍然是CHM 免疫细胞中的主要亚群，但在进展为GTN 的分组中CD56+NK 细胞相对较少，虽然差异并不显著，但这提示葡萄胎CD56+NK细胞可能具有细胞毒性，并且弱化的NK细胞杀伤效能可能与较差的CHM 清宫后预后有关。研究认为，正常妊娠的母胎界面dNK 细胞通常可分为3 种亚群（CD56brightCD16－、CD56superbrightCD16－和CD56dimCD16+）[29]，因此，尽管CD56+NK 细胞是dNK 细胞的主要亚群，仅凭借CD56 标志能否代表所有的NK 细胞需要进一步讨论。总之，葡萄胎母胎界面微环境与正常妊娠的母胎界面微环境呈现差异，葡萄胎滋养细胞可能不具备诱导低毒性的CD56superbrightdNK 的能力。葡萄胎滋养细胞与母胎界面免疫细胞的相互作用在GTD的发生、发展中具有重要作用。较强的免疫原性及诱导母胎界面产生足够强度的免疫反应可能是葡萄胎的良好预后因素。

3.2 葡萄胎患者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）可能呈现耗竭表型葡萄胎作为一种特殊的妊娠状态，其外周血免疫微环境也可能继发形成独特的免疫环境。基于Nod样受体家族含pyrin 结构域蛋白7（Nod-like receptor family pyrin domain-containing protein 7，NLRP7）突变导致的家族性复发葡萄胎（familial recurrent hydatidiform mole，FRM）的研究表明，来自具有多个NLRP7 非同义变异（non-synonymous variations，NSVs）表型的FRM患者的PBMC在脂多糖（lipopolysacchatide，LPS）刺激后表现出较低的IL-1β、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）分泌能力[30]。进一步实验证实，NLRP7 的NSVs 可影响IL-1β 的加工及运输。研究表明，NLRP7 既可作为炎症小体信号的负调节剂，也可作为巨噬细胞内炎症小体感知信号的传感器，沉默NLRP7 可抑制IL-1β 及IL-18 的释放[31]。IL-1β 被认为是急性炎症反应以及激活抗肿瘤反应的细胞因子[32]。IL-1β 的低响应可能表明免疫抑制状态与葡萄胎的发生、发展存在某种关联，但由于NLRP7 在卵母细胞减数分裂过程参与细胞骨架形成，其可能与异常的卵子形成有关[33]，因此基于该研究结论尚不足以证实免疫抑制在葡萄胎发生、发展中的关键作用。2014 年潘丹等[34]研究指出，相对于正常妊娠，来自葡萄胎的PBMC 培养上清液在LPS 刺激前就有较高的IL-1β 水平，而在LPS 刺激后，其分泌量的变化并无显著差异，但在正常妊娠组IL-1β分泌显著增多。表明非FRM 的滋养细胞具有较高的免疫原性，导致PBMC 处于持续的炎症刺激状态，表现为IL-1β 的相对高水平，而储备能力不足，对LPS刺激产生较弱的IL-1β 分泌反应，但也不排除葡萄胎患者存在其他机制引起PBMC 免疫应答减弱的可能。持续的免疫原刺激耗竭免疫细胞与基因突变导致的低效率的免疫细胞响应可能是葡萄胎持续进展的原因之一。

趋化因子对免疫细胞的迁移行为具有调控作用，CXCL10 是趋化因子家族重要成员，可通过CXCR3诱导向1 型辅助性T 细胞（T helper cell 1，Th1 细胞）方向极化激活免疫细胞。有研究报道CHM 患者的血清CXCL10 水平明显高于PHM 患者及正常妊娠早期女性，预后分析显示CXCL10 与葡萄胎恶变相关，因此研究认为CXCL10 可能是导致葡萄胎恶变的危险因素[35]。然而该研究中80 例葡萄胎患者中至少有25 例具有临床高危因素，恶变率为16.25%，CXCL10是否是独立预后因素未予说明，CXCL10 作为预后指标是否优于hCG 及其他临床高危因素也未进行进一步论述，因此其结果的临床意义需要更多的临床数据予以支持。基于胎盘样本的免疫组织化学结果表明，葡萄胎恶变组CXCL10 的表达阳性率和免疫反应强度高于未恶变组，且在滋养细胞肿瘤中表达更高[36]。说明具有恶变倾向的葡萄胎滋养细胞具有较高的CXCL10 分泌能力，以诱导趋化PBMC 向母胎界面局部富集。这或许可以解释上述葡萄胎患者母胎界面局部免疫细胞浸润数量高于正常妊娠女性，也与上述来源于葡萄胎患者的PBMC 在LPS 诱导后具有较低的IL-1β 响应率相互印证。但仍需解释的问题是：为何高表达趋化因子、具备招募更多活化淋巴细胞能力的葡萄胎患者具有更高的恶变率？具备恶变潜能的葡萄胎滋养细胞是否具有类似肿瘤的机制，诱导促炎型免疫细胞向抑炎型免疫细胞分化，形成免疫耐受的微环境，促进其进展为GTN？以及如何鉴别这种具有恶变潜能的葡萄胎滋养细胞？

4 结语与展望

葡萄胎滋养细胞具备趋化外周免疫细胞在母胎界面局部富集能力，并且诱导免疫细胞向具备细胞毒性的表型分化，如Tc 及具有杀伤能力的NK 细胞，但具体机制仍不清晰，需进一步研究。有恶变潜能的葡萄胎滋养细胞诱导的免疫反应和可自发缓解的滋养细胞诱导的免疫反应有何不同，如何鉴别这种恶变潜能的葡萄胎滋养细胞仍是需要解决的问题，也是进行临床决策的重要问题。目前，由于诊断技术进步，诊断窗口提前，典型清宫术前诊断葡萄胎标本越来越少、原代葡萄胎细胞分离技术有限等困难限制了其基础研究的发展。多重免疫组织化学以及空间转录组技术的出现，给CHM、PHM 的免疫学研究提供了新的可能，有望利用石蜡标本回顾性解答上述问题。解决这些问题，不仅有助于对葡萄胎免疫学发生、发展的理解，也有助于理解GTN 的形成机制，指导临床决策（清宫术后是否需要预防性化疗），还有助于寻找滋养细胞肿瘤耐药相关的免疫学机制。