自噬在子宫内膜异位症发病机制中的研究新进展

谈佳欢，张宗峰

子宫内膜异位症（endometriosis，EMs）是指有活性的子宫内膜组织在子宫腔以外部位种植生长形成病灶，并周期性地反复出血，引起相关临床症状及表现，如进行性加重的痛经、慢性盆腔痛及不孕等，甚至导致痛觉过敏和情绪障碍[1]，严重影响育龄期女性的物质及精神生活质量。然而现阶段EMs 的发病机制尚不清楚，仍需进一步探究。自噬（autophagy）是一种程序性细胞死亡的非凋亡形式，是细胞内蛋白质和细胞器降解的主要途径，参与各种生理病理过程。近年来，越来越多的研究聚焦于自噬在EMs 中的作用，现归纳总结自噬在EMs 中的研究进展，并对自噬在EMs 发病机制中的作用进行综述。

1 自噬概述

自噬是细胞吞噬自身细胞质中异常蛋白或细胞器并将其降解的过程，包括将这些成分包被入囊泡，与溶酶体融合形成自噬溶酶体，自噬溶酶体将其降解等各个阶段，从而实现细胞本身的代谢需要和细胞器的更新。自噬是受复杂信号精细调控的生物学过程，一般分为3 个阶段：①自噬起始阶段，在细胞接收到自噬诱导信号后，细胞内形成类似脂质体双分子层结构的吞噬体。②自噬小体形成阶段，吞噬体随着自噬的发展不断延伸，细胞内弥散的胞质型微管相关蛋白1 轻链3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，MAP1LC3/LC3-Ⅰ）将降解转变成膜型的LC3-Ⅱ募集到隔离膜上，双层膜将需要降解的细胞内物质包围，形成闭合的双层膜结构的自噬小体。③自噬溶酶体阶段，自噬小体携带需降解的胞内成分与溶酶体融合形成自噬溶酶体，溶酶体内蛋白酶进一步降解自噬小体内组分，其降解产物中的营养物质被输送到细胞质中，供细胞自我营养和代谢循环，其他降解残渣被排出细胞外或滞留于细胞内，以达到细胞稳态[2]。自噬通过蛋白质和脂类降解产生能量供给，消除异常的细胞器，维持细胞的生存和细胞的代谢[3]，是细胞质成分降解和再循环的高度保守进化机制。

自噬参与许多生理病理过程，如维持细胞稳态、调节细胞生长和免疫逃逸等，因此自噬功能障碍与很多疾病相关，如肿瘤、肥胖症、神经退行性疾病、自身免疫性疾病和心血管疾病等[4-5]。目前研究人员深入研究调节和执行自噬的分子机制，试图研发可以精准靶向一个或多个自噬关键分子的激动剂或抑制剂类药物，以激活或阻断自噬，进而达到治疗疾病的作用。越来越多的研究证明自噬在EMs 的各阶段中发挥主导作用，因此可以期待自噬将成为治疗EMs的新方向。

2 EMs 异位病灶中的自噬水平

自噬水平的衡量包括蛋白质印迹（Western blotting）测定自噬相关蛋白（LC3、P62 和Beclin-1等）的表达水平、透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM）观察组织或细胞中自噬小体的形成以及免疫荧光法观察LC3 斑点数量等3 种主要方法[6]。自噬作为复杂而精细的调控机制，有许多自噬相关基因（autophagy related gene，ATG）参与其中，并发挥着关键作用。LC3 和P62 被认为是主要的自噬标志物。自噬激活后，LC3 从LC3-Ⅰ转换到LC3-Ⅱ并定位到自噬小体膜上，P62 蛋白在自噬降解中类似“底物”，与细胞内待降解成分结合，最后被自噬溶酶体降解。此外，Beclin-1 是诱导自噬的关键因子，可以介导自噬小体成核过程。因此，在自噬过程完整通畅的情况下，LC3-Ⅱ和Beclin-1 水平与自噬水平呈正相关，而P62 水平与自噬水平呈负相关。

自噬是一种自我保护的机制，在疾病的各个阶段自噬水平波动不定。既往有研究通过免疫组织化学染色法检测月经周期不同阶段健康女性和EMs患者子宫内膜组织中LC3-Ⅱ和P62 蛋白的表达水平，发现健康女性子宫内膜分泌期的自噬水平比增殖期低，而EMs 患者在位和异位内膜组织的自噬水平在月经周期中无明显变化。这一结果说明正常子宫内膜的自噬水平随月经周期呈周期性变化，而EMs 患者内膜组织的自噬水平的周期性变化消失[7]。因此认为，EMs 患者子宫内膜自噬水平的异常和周期性变化消失可能与疾病的发生、发展有关。

目前大量研究针对EMs 患者内膜组织的自噬水平对比正常子宫内膜究竟是上升还是下降进行探索，大部分学者通过实验证明自噬水平在EMs 异位病灶中下调[8-9]。用免疫组织化学染色法对EMs 和子宫肌瘤患者的子宫内膜组织石蜡切片中LC3、P62和Beclin-1 的表达水平进行半定量分析发现，EMs患者在位和异位内膜组织中LC3 和Beclin-1 下调，P62 上调，提示EMs 在位和异位内膜组织中的自噬水平均低于子宫肌瘤患者，且EMs 患者异位内膜的自噬水平比在位内膜更低[10]。根据美国生育协会修订标准（revised-American Fertility Society，r-AFS）将EMs 患者分为Ⅰ～Ⅱ期和Ⅲ～Ⅳ期，发现Ⅲ～Ⅳ期EMs患者病灶自噬水平比Ⅰ～Ⅱ期患者更低[7]。EMs 是雌激素依赖性疾病，也是一种慢性炎症。研究发现EMs患者高水平的雌激素可以导致异位内膜间质细胞的自噬水平下降，并促进间质细胞分泌炎性细胞因子，进一步促进EMs 炎性微环境的形成[11-12]。血清糖类抗原125（carbohydrate antigen 125，CA125）被公认为是EMs 诊断和分期的标志物，其升高与EMs 病情进展和炎症反应活跃有关。研究发现EMs 组患者血清CA125 水平比非EMs 组明显升高，EMs 患者的在位和异位内膜Beclin-1 水平下降，且血清CA125 水平与在位内膜Beclin-1 蛋白水平呈负相关（r=－0.566，P=0.003）[13]。但也有少量研究认为EMs 患者异位病灶的自噬水平比在位内膜和正常内膜更高，并认为自噬水平的升高主要由降低的凋亡水平和持续的氧化应激触发[14]。EMs 异位病灶自噬水平与正常内膜孰高孰低的结论不一致，可能与检测方法不同、样本量不足和个体差异等因素有关，还需要进行大量研究获得更具说服力的统一结论。

3 EMs 病灶环境中影响自噬水平的因素

EMs 病理机制复杂，许多因素参与调控其自噬水平，包括激素、缺氧和氧化应激、病原体感染以及铁离子等。

3.1 激素正常子宫内膜组织的自噬水平随月经周期变化[7]，这可能是由于卵巢分泌的雌、孕激素周期性改变导致自噬水平的波动。EMs 异位病灶中增多的雌激素通过上调趋化因子12（C-X-C motif chemokine ligand 12，CXCL12）及其受体CXCR4 活性，下调细胞LC3、Beclin-1 蛋白水平，上调P62 蛋白水平，减弱自噬水平[12]。雌激素降低异位内膜间质细胞自噬水平，导致信号转导及转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）失活，Scr 家族酪氨酸激酶HCK 表达下调，促进下游分子CXCL8、白细胞介素8（interleukin-8，IL-8）和IL-23A 分泌增加，进而引起自然杀伤（nature killing，NK）细胞毒性下降。下降的NK 细胞毒性影响了NK细胞对腹腔中异位内膜组织的清除功能，导致EMs 异位病灶的局部免疫微环境紊乱，促进病灶生长[11]。在EMs 的发生、发展过程中孕激素和雌激素起拮抗和协同作用，此交互关系在调节内膜组织自噬水平过程中同样有所体现。卵巢切除小鼠模型用外源性雌激素和孕激素干预可以降低子宫内膜的自噬反应，表明两种激素在调节自噬水平过程中起到协同作用[15]。然而，还有研究表明，孕激素对EMs 异位内膜间质细胞的自噬有激活作用[16]，能抵消雌激素降低的自噬水平。在EMs 异位内膜间质细胞中，孕激素通过遏制蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）和细胞外信号调节激酶1/2（extracellular signal-regulated protein kinase 1/2，ERK1/2）的活性，抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）激活，导致间质细胞自噬激活，促使细胞凋亡[17]。

3.2 缺氧和氧化应激根据桑普森理论，脱落的子宫内膜细胞或碎片逆行到腹腔时，首先面对的环境压力是局部改变的缺氧微环境。越来越多的研究表明EMs 可能与缺氧和氧化应激有关，缺氧是EMs 重要的微环境因素，可以诱导细胞释放氧自由基，当氧自由基过量超出抗氧化清除系统的能力范围时，会导致细胞损伤等系列反应，即氧化应激[18]。EMs 异位内膜间质细胞在缺氧条件下，缺氧诱导因子1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）介导通路促进LC3 蛋白表达，激活自噬[19]。缺氧环境可以通过引起异位内膜间质细胞中长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）-肺腺癌转移相关转录本1（metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1）水平增高，以促进自噬呈时间依赖性增强，从而导致间质细胞抗凋亡能力[20]以及上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）增强，最后促进病灶迁移、侵袭[21]。持续的氧化应激可以激活自噬反应，EMs 中氧化应激相关蛋白血红素加氧酶1 表达水平显著升高，促进自噬激活，加快EMs的病理发展[14]。给EMs 大鼠腹腔灌注抗氧化剂抑制活性氧（reactive oxygen species，ROS），可以逆转低氧诱导的自噬反应，降低异位病灶中LC3 和Beclin-1的水平。因此，抗氧化疗法是未来EMs 的潜在治疗策略[22]。

3.3 其他因素还有许多其他因素影响了EMs 的细胞自噬活性，如病原体感染和铁离子等。宫内细菌感染是EMs 的病因之一，然而女性生殖道感染不止有细菌，还有其他病原体。在EMs 异位间质细胞中，病原体感染导致细胞自噬受损，细胞释放肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和IL-1β 增多，促进炎性微环境形成[9]。EMs 病灶的一个重要特性是周期性出血，血细胞破坏释放出大量铁离子导致铁过载。许多研究证明，铁过载是EMs 发病机制中的关键环节。在EMs 相关卵巢癌的囊液中含有丰富的铁离子，铁以Ras 和有丝分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）依赖的方式增强细胞自噬，另外，铁离子通过持续诱导氧化应激也可以激活自噬[23]。因此，铁离子能促进细胞自噬，但是在EMs 病灶中铁离子促进自噬的具体作用机制还需要进一步的研究。

4 自噬对EMs 的双重作用

许多研究数据支持自噬在肿瘤中的双重作用，既可以作为肿瘤早期发展的抑制因子，也可以作为后期阶段肿瘤维持和治疗耐药的促进因子[24]。EMs作为一种妇科良性疾病，却有与肿瘤发生、发展类似的病理过程，郎景和教授在“在位内膜决定论”中提出逆流入腹腔的子宫内膜需实现黏附、侵袭和血管生成等3 个关键环节，才能在异地形成病灶并生长。愈来愈多的研究证明，自噬在EMs 发展的不同环境和阶段中由于激素波动、微环境应激和免疫系统失衡等因素产生动态改变，发挥抑制或促进疾病进展的双重作用。

4.1 自噬对EMs 的抑制作用许多研究认为自噬是EMs 进展的抑制因素，可以通过抑制炎症反应[8]、增强免疫系统清除病灶能力[16]和抑制病灶纤维化[25]等阻碍EMs 的进展，是治疗EMs 的潜在策略。核苷酸结合寡聚化结构与受体家族含CARD 结构域5（nucleotide-bindingoligomerization domain-like receptor family CARD domain containing 5，NLRC5）是NLR家族中发现的新亚类，在调节炎症反应中发挥主导作用。研究发现EMs 异位子宫内膜的炎症状态激活了NLRC5，促进NLRC5 在异位内膜间质细胞中高表达，进而介导抗炎反应。值得注意的是，自噬参与了NLRC5 的抗炎作用，自噬激活剂雷帕霉素通过促进自噬有助于NLRC5 介导的抗炎作用，而自噬抑制剂氯喹通过抑制自噬可以抵消NLRC5 介导的抗炎作用。因此，自噬可以通过介导NLRC5 的抗炎作用来抑制EMs 异位子宫内膜的炎症环境[8]。

此外，对EMs 小鼠腹腔注射原人参二醇可以抵抗异位病灶间质细胞中雌激素受体介导的自噬抑制效应，从而促进小鼠异位病灶自噬增强，增强微环境中NK 细胞毒性。自噬促进的NK 细胞杀伤力增强有助于清除腹腔内的异位子宫内膜组织，减少小鼠异位病灶的数量，抑制异位病灶的生长[16]。

流行病学研究表明，EMs 患者心理压力大，伴有抑郁和焦虑[26]。动物实验证明，心理压力增加能促进EMs 的发展，加剧疾病相关的疼痛[27]。研究人员给EMs 模型小鼠提供丰富的环境（扩大的空间、增加的体育活动和社会互动）以减轻小鼠的心理压力，发现丰富环境组小鼠异位病灶增大减缓，提示丰富的环境可延缓EMs 的进展。通过对丰富环境组和正常环境组的小鼠异位病灶切片进行Masson 染色和免疫组织化学染色发现，丰富环境组小鼠异位病灶纤维化程度降低，LC3 表达增多，多巴胺D2 受体（dopamine D2 receptor，DRD2）表达增多，肾上腺素受体β2（adrenergic receptor β2，ADRB2）减少，且LC3 表达水平与病灶纤维化程度呈负相关（r=-0.42，P=0.007）。因此，丰富的环境主要是通过增强DRD2、减弱ADRB2 和增强自噬降低病灶纤维化程度，改善痛觉过敏，阻碍EMs 进展，再次肯定了自噬在EMs疾病发生、发展中的抑制效应[25]。

4.2 自噬对EMs 的促进作用还有一些研究人员聚焦于研究自噬促进EMs 进展的作用机制，主要通过促进细胞存活[19]和细胞迁移、侵袭[21]等方面。腹腔局部缺氧是EMs 发病机制中关键的微环境因素，HIF-1α 的表达量在异位子宫内膜中明显增多。研究人员发现缺氧可以诱导异位子宫内膜间质细胞中lncRNA-MALAT1 的水平增高，自噬增强，而缺氧条件下沉默异位内膜间质细胞的lncRNA-MALAT1 可以抑制缺氧激活自噬，提出缺氧可以诱导异位子宫内膜间质细胞中lncRNA-MALAT1 的水平增高，引发细胞保护性自噬，促进逆行入腹腔的子宫内膜组织在异位存活并生长[20]。

此外，在缺氧处理后的异位子宫内膜上皮细胞，自噬标志物LC3 和间质细胞标志物波形蛋白表达上调，上皮细胞标志物E-钙黏蛋白表达下调，提示自噬活性和EMT 增强，并且细胞迁移和侵袭能力增强。用自噬抑制剂抑制自噬可以逆转缺氧引起的EMT，并减弱细胞迁移和侵袭能力。因此，自噬在EMs 异位内膜上皮细胞中介导EMT，促进细胞迁移和侵袭，促进疾病进展[21]。

5 结语与展望

越来越多的证据表明自噬在EMs 的发病机制中有重要作用，自噬受EMs 病灶微环境中激素水平、缺氧和氧化应激以及铁过载等众多因素调节，参与异位病灶发生、发展的不同环节。自噬的异常活性已被证实在EMs 中发挥重要作用，而自噬对EMs 发生、发展的作用是双重的。科研的目的是应用于临床，究竟是诱导自噬还是抑制自噬以获得治疗EMs的益处仍有待确定。此外，由于自噬在细胞稳态中起关键作用，在研发通过调节自噬活性治疗EMs 的药物时，也应考虑效价和毒性之间的平衡。