类器官技术在卵巢癌药敏检测中的应用

汪娅妮，姜琦，张雨晨，诸海燕

卵巢癌是致死率最高的妇科恶性肿瘤，国际癌症研究所（International Agency for Research on Cancer，IARC）统计显示，2020 年全球卵巢癌新增病例313 959 例，死亡207 252 例[1]。卵巢癌有多种病理类型，最常见的是上皮性卵巢癌，约占90%以上，性索间质肿瘤占5%～6%，生殖细胞肿瘤占2%～3%。卵巢癌的初始治疗为全面分期手术或肿瘤细胞减灭术，术后辅助紫杉醇联合铂类的化疗，而标准的初始治疗后约70%的患者会复发[2]。复发性卵巢癌主要采用化疗、靶向药物等治疗。近些年，新的靶向药物在卵巢癌中的应用使卵巢癌治疗模式发生了改变，但由于卵巢癌的异质性和多态性，这些药物的总有效率约为20%[3]，同时医师基于临床指南和以往经验选择的药物无法做到个体化的精准治疗。因此，构建一个精准预测卵巢癌治疗效果的临床前模型，指导卵巢癌的个体化治疗，一直是卵巢癌的研究重点。

现有的临床前模型包括细胞系、动物模型以及患者来源的肿瘤异种移植（patient-derived xenograft，PDX）模型和类器官（patient-derived organoid）等。类器官是一种新型体外3D 培养技术，其以干细胞或器官祖细胞为原料，在添加多种生长因子、抑制因子和激素的基质胶中进行培养，自组装为器官样结构的细胞群。由于其能很好地维持肿瘤细胞的异质性，因此基于类器官的药物筛选结果与临床实际治疗效果有较高的符合度；同时类器官培养技术具有方便、快捷、易于制备和成功率高等优点，使得其在肿瘤药物研究方面有着巨大的潜能。近年的类器官热度起源于荷兰的Hans Clevers 教授，2009 年Clevers 团队首次在培养基中添加表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）、Wnt 信号激动剂、R-脊椎蛋白1（roof plate-specific spondin 1）和骨形成蛋白信号抑制剂头蛋白（Noggin）等，在体外成功培养出小肠类器官[4]。2011 年，该团队又引入烟酰胺、p38 抑制剂和Alk 抑制剂A83-01，成功培养出结肠的多种疾病类器官模型[5]，此后，肝癌[6]、乳腺癌[7]等恶性肿瘤类器官均成功培养并初步应用于临床。研究表明这些类器官的组织病理学特征、基因突变类型和药敏测试结果与在体肿瘤高度一致，是目前肿瘤研究最有效的手段，但同时类器官因具有器官限制性及缺乏免疫细胞等缺点而暂时无法得到广泛应用。现介绍卵巢癌类器官的起源发展及其在卵巢癌药物治疗中的研究进展。

1 卵巢癌类器官的建立

2018 年，Hill 等[8]首次将22 个卵巢癌患者的实体瘤与胸腔穿刺液作为祖细胞，制成肿瘤细胞颗粒，用缓冲液进行洗涤，将其与Matrigel 基质胶混合成细胞悬液，再向其中加入含有青霉素、EGF、成纤维细胞生长因子2（fibroblast growth factor 2，FGF2）和烟酰胺等的普通培养基液，最终培养出33 个高级别浆液性卵巢癌（high-grade serous ovarian carcinoma，HGSOC）类器官模型，培养成功率接近100%。HE 染色和免疫组织化学分析显示，类器官保留了原肿瘤的核多形性、致密染色质等所有特征。经过全外显子组测序，Hill 等[8]发现培养7～10 d 的类器官中的基因突变有98.8%也存在于母体肿瘤中，初步证明培养7～10 d 的类器官可以作为患者临床反应的预测工具。2019 年，Kopper 等[9]成功培养了来自32 例卵巢癌患者的56 个类器官，建立了首个卵巢癌活体生物库，其中包含了浆液性交界性肿瘤、HGSOC、低级别浆液性癌和透明细胞癌等上皮性卵巢癌的所有亚型，且保留了原发肿瘤的基因特征，使卵巢癌类器官研究取得重大突破。同年，Phan 等[10]首次尝试将类器官用于高通量药物筛选。后来Hart 等[11]成功利用卵巢癌类器官模型模拟卵巢癌的早期腹膜转移，研究发现腹膜中的间皮细胞与卵巢癌细胞直接接触有利于癌细胞的黏附与转移。2020 年，Maenhoudt 等[12]分别利用新鲜的肿瘤组织和冷冻保存的活检组织在添加了神经调节蛋白1（neuregulin-1，NRG1）的培养基中成功培养出卵巢癌类器官，2 种组织培养的成功率都是44%，从而提出了在类器官建立之前储存临床样本的可能性。

2 类器官在卵巢癌药物筛选中的应用

自Hill 等[8]2018 年成功构建了卵巢癌类器官之后，类器官培养技术在卵巢癌发病机制与药物研究方面得到广泛应用。Maenhoudt 等[12]利用类器官模型发现，氧化应激和肿瘤蛋白p53（tumorproteinp53，TP53）、磷脂酰肌醇3 激酶催化亚单位α（phosphatidylinositol 3-kinase catalytic subunit alpha，PIK3CA）等基因参与了卵巢癌的发生。Jabs 等[13]通过建立同源重组缺陷评分模型对类器官和细胞系培养进行高通量药物筛选，结果显示卵巢癌类器官模型对卡铂和地西他滨的反应性更加多元化。最近的气液界面（air-liquid interface）培养成功建立了肿瘤免疫微环境[14]，气液界面培养与微流体技术（microfluidic technology）使类器官在免疫治疗领域的应用成为可能。

目前，类器官技术在恶性肿瘤药物研究中主要应用于以下4 个方面：①探索肿瘤的耐药性；②研究药物的联合作用以寻找最优的药物组合方案；③找到药物对肿瘤的特定靶点，为新药研发提供依据；④进行高通量药物筛选，达到个体化治疗的目的。目前，类器官技术已被应用于多种恶性肿瘤的药物筛选，如利用人肾癌类器官进行顺铂疗效的评估[15]、利用结肠癌类器官评估伊立替康在患者体内的分布情况[16]。但是，类器官技术在卵巢癌诊断和治疗中应用的研究尚不多见。2020 年，Maenhoudt 等[12]分别利用新鲜的肿瘤组织和冷冻保存的活检组织成功培养出卵巢癌类器官，随后，该团队根据类器官是否经过冷冻保存、卵巢癌病理类型以及是否接受过化疗将其分类，并对分类后的类器官进行常用化疗药物的敏感性检测，研究发现野生型TP53 卵巢癌类器官对Nutlin-3 的敏感性高于突变型TP53 卵巢癌类器官。同年，Nanki 等[17]利用含有Wnt-3A 和R-脊椎蛋白等的鸡尾酒培养基建立了7 对卵巢癌类器官，其中3 对来自浆液性癌，3 对来自子宫内膜样癌，1 对来自透明细胞癌，类器官培养的总成功率为80%（28/35）。Nanki 等[17]用顺铂、卡铂、紫杉醇、多西他赛、去甲长春碱和托泊替康等23 种美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）批准的药物，对这7 对卵巢癌类器官进行药敏试验，根据药物的剂量-反应曲线判定结果，结果显示含有乳腺癌易感基因1（breast cancer susceptibility gene 1，BRCA1）突变的类器官对多腺苷二磷酸核糖聚合酶[poly（ADP－ribose）polymerase，PARP]抑制剂、奥拉帕尼和铂类药物更敏感，而来自透明细胞癌的类器官则对铂类药物、紫杉醇和奥拉帕尼显示抵抗性。2018 年，Hill 等[8]发现大约有50%的HGSOC 患者存在DNA损伤修复缺陷，类器官中DNA 损伤修复缺陷都与PARP 抑制剂的敏感性相关，因此PARP 抑制剂可能是这些患者的潜在治疗药物。由于类器官模型具有培养快速、方便的特点，目前已有学者将其用于高通量药物筛选，以提高药物筛选的效率。2019 年，Phan等[10]首次尝试利用卵巢癌患者来源类器官进行高通量药物筛选，结果提示基于类器官技术的高通量药物筛选在卵巢癌的治疗中有一定的应用价值。近年来的研究都显示使用类器官进行药敏试验可以筛选出具有治疗潜力的药物，能够为新药的应用奠定基础，也有助于为患者提供个性化的治疗方案。

3 类器官在肿瘤药敏检测应用中的优点

卵巢癌药敏检测对传统化疗药物或新型靶向药物的有效性筛选具有重要作用。细胞系是卵巢癌最常用的临床前模型，因其技术简单、成本低且成功率高，已广泛用于高通量药物的筛选；但在长期培养过程中无法维持其肿瘤异质性，最终细胞系的药敏结果与临床实际疗效呈现较大差异[18]。目前常用的体内动物模型包括细胞系异体移植模型和PDX。细胞系异体移植模型是将肿瘤细胞注射到免疫缺陷小鼠体内，相比于细胞系培养能更好地模拟肿瘤的发生与发展过程，并且其药物筛选实验结果与临床试验结果较为一致，但动物模型存在一定的伦理争议，昂贵且耗时长，这限制了动物模型的运用。PDX 是将患者新鲜的肿瘤组织直接移植到免疫缺陷小鼠体内，使肿瘤组织在小鼠体内生长而构建成的肿瘤模型，此类模型保持了与患者相似的遗传特性和肿瘤异质性[19]，但其受限于建模率低（20%～50%）、周期长（4～8个月）和成本高等问题，不适合高通量药物筛选。而类器官具有维持肿瘤异质性和模拟肿瘤微环境的优点，使其在肿瘤药敏检测中有较大应用优势和潜力。

类器官可以维持肿瘤的异质性。类器官是以干细胞或器官祖细胞为原料，添加细胞外基质替代物Matrigel 胶作为立体支架，最终培养形成的三维细胞团，具有和原位组织相似的结构和功能特性[20]。相较于传统的肿瘤细胞和动物模型，类器官不仅较好地保留了肿瘤原有的组织学形态、遗传信息和肿瘤异质性，还具有传代稳定、培养周期短和取材灵活等特点。肿瘤异质性是恶性肿瘤的重要特征，也是造成肿瘤药物治疗失败的主要原因。卵巢癌具有较高的异质性：上皮性卵巢癌主要包含浆液性癌、子宫内膜样癌、透明细胞癌和黏液癌这几种亚型，其致癌基因、预后等均存在较大差异。类器官可以培育出各种类型的卵巢癌，同时相较于其他培养体系，类器官能够维持卵巢癌的异质性[21]。Kopper 等[9]对原发病灶和转移病灶的类器官进行全基因组测序，发现类器官与原癌组织的拷贝数变异（copy number variation，CNV）数据与癌细胞比例相同。Nanki 等[17]用23 种FDA 批准的药物对7 对卵巢癌类器官进行药敏试验显示，约59.5%的原肿瘤与相应类器官的试验结果相同。

类器官可以较好模拟肿瘤微环境。类器官培养系统主要由来自于特定组织的祖细胞和人工基底膜或其他适宜的细胞外基质组成。细胞外基质是信号在不同细胞间传输的中间媒介，通过合成、降解、排列和交联来改变组成和结构，细胞外基质的改变反过来作用于细胞基质黏附受体的信号传导，最终影响组织极性、结构、血管生成和癌细胞侵袭等[22]。类器官培养系统中的细胞外基质是一种富含多糖修饰的带电蛋白网络，能与多种生长因子结合。同时细胞外基质还包含大量的糖蛋白、蛋白多糖和多聚糖等具有不同生化和物理特性的成分[23]。细胞系培养仅仅将祖细胞在含有营养物质的培养基上进行培养，培养基内并没有肿瘤生长所必需的生长因子，缺少基质细胞、细胞间的信息传递以及细胞外基质[24]。体内动物模型维持了染色体的结构，相比于细胞系能更好地维持肿瘤的异质性。但是由于体内动物模型是将祖细胞注射入免疫缺陷小鼠的体内，因此肿瘤微环境的免疫作用并不能得到充分体现[25]，这导致一些免疫药物实验没办法在动物模型体内进行，因此也存在一定的局限性。而类器官细胞外基质很好地模拟了肿瘤的微环境，为肿瘤的发生提供了生长所必需的条件。

4 类器官在肿瘤药敏检测应用中的缺点

迄今为止，类器官培养技术尚未完全成熟，肿瘤类器官培养技术存在以下缺点：①正常上皮细胞的过度生长；②缺乏免疫细胞、血管细胞和基质细胞，无法模拟肿瘤免疫环境及血管形成等；③器官限制性，无法培养所有的肿瘤及所有的非肿瘤成分等。

为解决类器官缺乏免疫细胞、基质细胞的问题，3D 共培养技术已经逐渐进入人们的视野，有学者将类器官与免疫细胞进行共培养，模拟肿瘤发展过程中免疫细胞的作用并获得了成功[26]。改良之后的类器官还可进行免疫治疗的临床前试验，已经有学者成功地将类器官与免疫细胞共同培养来预测免疫治疗的效果[26]，但目前还无法将卵巢癌类器官与免疫细胞进行共同培养。3D 共培养技术也成功解决了基质细胞与类器官之间缺乏相互作用的问题[27]。有学者利用大网膜的原代间皮细胞和成纤维细胞的早期传代在体外重建了卵巢癌的肿瘤微环境，虽然该系统比较复杂，但若将其与卵巢癌类器官结合可能会成为药物筛选的下一代模型[28]。微流体技术是利用微小通道模仿人体血管，研究血管因素在肿瘤发生与发展过程中的作用[29]，随着微流体技术的发展，3D培养技术已经能更好地与微流体技术相结合[30]。相信在不久的将来，类器官的这些局限性将会被新的技术一一攻克。

5 结语

类器官培养技术作为一种新型的细胞培养方式，由于其肿瘤复制程度高、较好地保留肿瘤异质性、生长周期短及可稳定传代等优势，弥补了细胞系和动物模型等临床前模型的缺陷，在肿瘤药物筛选和个性化治疗方面具有巨大的潜能。卵巢癌类器官的成功培养和制备使其在卵巢癌方面的应用也逐渐进入人们的视野。一方面，卵巢癌类器官可以模拟卵巢癌的发展进程，通过对卵巢癌的癌前状态进行研究，发现卵巢癌生长过程中的基因突变位点，为疾病诊断和新药研发提供依据，实现疾病的早发现、早诊断和早治疗；另一方面，目前类器官已经应用于卵巢癌的药敏试验，结合高通量药物筛选，为将来患者的个性化治疗提供临床前试验依据。另外，通过对患者来源的类器官进行培养，可以评估患者预后，为及时调整治疗方案做出前瞻性判断。但是类器官和功能齐全的器官还有较大的差距，而且类器官技术也存在局限性，其不能完全模拟肿瘤免疫环境并且具有一定的器官限制性。目前，高速发展的共培养技术、微流体技术已经在逐步克服类器官的缺陷，相信在不久的将来，类器官技术将会更加完善，从而实现卵巢癌的个性化治疗。