类器官在肿瘤研究中的应用

黄华，姚书忠

体外培养2D 细胞（如细胞系、原代细胞）因其简单易获取、操作成熟及可重复性高等优点，是现行肿瘤研究中最常用的肿瘤模型。但随着进一步的研究发现，肿瘤的遗传异质性、肿瘤与肿瘤微环境间的相互作用等肿瘤特性与肿瘤的发生发展、抗药耐药等肿瘤生物学行为息息相关[1-2]。而肿瘤细胞系在体外培养时脱离了原有的复杂体内生存环境，经过体外单一环境的长期选择性培养、细胞系内适应性克隆扩增和非适应性克隆丢失，使其失去了原肿瘤的遗传异质性。肿瘤细胞系内细胞组成单一，仅由肿瘤细胞构成，不包含间质细胞、内皮细胞和免疫细胞等，无法模拟肿瘤微环境；而另一种常用的人类肿瘤研究模型——患者来源的肿瘤异种移植（patient-drived xenograft，PDX）模型直接来源于患者，能准确反映肿瘤的遗传异质性，也可联合基质一同植入，模拟肿瘤微环境，但PDX 模型成本高、耗时长等缺点限制了其在肿瘤精准治疗中的广泛应用。近年来发展迅速的3D 肿瘤模型与PDX 模型相同，直接来源于患者，能够保留肿瘤特性，模拟体内肿瘤微环境，使离体培养的肿瘤细胞处于一个更接近于真实环境的状态，与常用的2D 细胞相比，其能更好地反映原肿瘤的细胞形态和组织结构，保留细胞与细胞外基质、细胞与细胞之间的相互作用，并提高了高通量平台在肿瘤药物筛选研究中的应用[3-4]。常见的体外培养3D 肿瘤模型按培养方式分为以下3 类：①悬浮球状肿瘤模型（floating spherical cancer models），低吸附平板上培养的肿瘤细胞悬浮聚集而形成的肿瘤细胞球[5]；②基于支架的3D 肿瘤模型（scaffold based 3D cancer models），即细胞或细胞簇嵌在模拟肿瘤体内细胞外基质支架的肿瘤模型，其中研究较为广泛的有类器官（organoids）[6]和基于支架的多种细胞共培养模型；③肿瘤芯片（tumor on a chip），结合了能模拟体内生物物理微环境微流体技术的3D 肿瘤模型[7]。在众多体外培养3D 肿瘤模型中，类器官可模拟肿瘤体内细胞外基质环境，且操作较为简单。这些特性使肿瘤类器官模型成为近年来的研究热门。类器官是指在体外环境下，由有自我组织和自我更新能力的干细胞分化发育而来的，具有多种细胞类型的能模仿原组织器官结构功能的三维结构。常见的肿瘤类器官来源有二，一是肿瘤组织直接培养（肿瘤干细胞属于成体干细胞）[8]；二是来源于经基因编辑技术处理的诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cell，iPSC）培养成的肿瘤类器官模型[9]。iPSC 的肿瘤类器官模型的产生效率取决于肿瘤类型以及该肿瘤是否存在特定的致癌突变，且大概率会导致选择性的肿瘤亚克隆生长和肿瘤遗传异质性的丧失，通常只用于研究特定基因突变在肿瘤发生、发展中的作用。而直接由肿瘤组织培养形成的肿瘤类器官可保留肿瘤异质性，比涉及基因编辑的iPSC 类器官培养似乎更为实用[10]，来源于肿瘤组织的类器官保持了亲本肿瘤的遗传特性，在肿瘤研究中更有个体代表性[6]。现探讨肿瘤类器官模型在肿瘤研究中的具体应用。

1 类器官的临床前应用

1.1 建立活体肿瘤类器官生物样本库（Biobank）生物样本库是一个储存和管理用于研究的生物样本的仓库。最早是Hans Clevers 团队在2015 年建立的20多例结直肠癌组织与临近正常组织配对构成的类器官的生物样本库[11]。类器官培养物仅由上皮细胞组成，对生物样本库内类器官样本进行基因检测及其表达分析，不会像直接对肿瘤组织进行检测一样受到间质、血管和免疫细胞等非肿瘤细胞的污染。匹配正常组织的全外显子组测序，Hans Clevers 团队观察到肿瘤类器官生物样本库中抑癌基因结肠腺瘤性息肉病蛋白（adenomatous polyposis coli，APC）、肿瘤蛋白p53（tumor protein p53，TP53）、F 框/WD-40 域蛋白7（F-box and WD-40 domain protein 7，FBXW7）和SMAD家族成员4（SMAD family member 4，SMAD4）的失活改变，在鼠类肉瘤病毒癌基因（kirsten rat sarcoma viral oncogene，KRAS；密码子12 和146）和磷脂酰肌醇3 激酶催化亚单位α（phosphatidylinositol 3-kinase catalytic subunit alpha，PIK3CA；密码子545 和1047）中的激活突变，类器官生物样本库总体突变分析结果与既往发现的结直肠癌的常见突变一致[11]。除了能保留原肿瘤的遗传学特性，肿瘤类器官还可模拟肿瘤在体内的形态结构[12-17]。在胃癌、乳腺癌、胰腺癌、膀胱癌和卵巢癌等多种肿瘤中，配对类器官及肿瘤组织病理学鉴定都显示出类器官对原肿瘤形态学和遗传学的准确模拟。1 例来源于宫颈透明细胞癌的类器官经液氮冻存后再次培育，也能维持原有的形态学特性[12]。在卵巢癌的类器官研究中还观察到，类器官对同一患者体内不同癌灶遗传异质性的保留，即同一个体不同病灶来源的肿瘤类器官包含不同的突变，并且在体外长时间的传代后，类器官和对应的癌灶在突变水平上仍然保持高度相似[17]。从上述研究结果中看出，肿瘤类器官保留并包含了对应肿瘤的染色体拷贝数变异和体细胞突变，且纯度更高，建立肿瘤类器官生物样本库有利于保存各类肿瘤的遗传学特征，包括罕见的肿瘤遗传变异谱。将肿瘤类器官生物样本库与正常组织对比可筛选潜在的肿瘤标志物[18]。既往的肿瘤生物样本库分析的大部分样本来自原发部位肿瘤的手术切除标本，这就意味着不适宜手术治疗的晚期肿瘤、转移瘤等重要样本难以收集入库。而越来越多的研究表明，穿刺活检组织甚至是胸腹水中获得的肿瘤细胞可建立类器官，并扩大培养[8，19-21]，扩大化的肿瘤样本来源更有利于生物样本库的多样化，利用肿瘤类器官生物样本库可建立更全面的肿瘤发生发展谱。与PDX 模型比较，类器官培养周期短，体外培养可长期扩展、冻存复苏，且可进行高通量的检测（药物筛选），建立肿瘤类器官生物样本库，可灵活取用分析其中多样的肿瘤类器官，更有利于进行肿瘤分子学背景与肿瘤生物学行为（如临床病理特征、药物反应或耐药关系等）模式分析，促进肿瘤精准治疗发展。与体外2D 细胞培养面临相同的问题，长时间的单一培养条件是否会造成类器官“克隆漂变（clonal drift）”仍需更多的实验探索[8]。

1.2 类器官与个体化治疗PDX 是现有较成熟的个体化治疗预测模型，在组织病理学、分子生物学和基因水平上保留了大部分原肿瘤的特点，对原肿瘤有较高的代表性，且在体外进行的药物敏感性测试结果和患者的临床治疗反应有较高的一致性，然而不可否认的是，PDX 模型的异种移植免疫排斥、耗时长（6～8 个月）、费用高等的缺点限制了其广泛应用[22-23]。而同样是患者来源的类器官是体外培养的3D 肿瘤模型，不需要在异种免疫缺陷鼠上进行肿瘤移植生长，可以较好地规避这些限制。既往的卵巢癌类器官研究将类器官解离后，在加入化疗药物的培养条件下进行细胞活力检测，判定类器官对药物的敏感性，结果显示高级别浆液性肿瘤来源的类器官对基于铂类的化疗敏感，而非高级别浆液性肿瘤来源的类器官对铂类化疗则表现出相对耐药的趋势。与配对的卵巢癌患者的临床反应一致[17]。在靶向治疗疗效判定上，Smith 团队发现KRAS 突变的结直肠癌类器官对西妥昔单抗有耐药性，而KRAS 野生型的结直肠癌类器官则对西妥昔单抗无耐药性[24]。复旦大学上海肿瘤中心从新辅助放化疗局部晚期直肠癌患者取样培养出80 例类器官，体外对类器官进行放化疗，发现类器官的放化疗敏感性与患者的放化疗反应高度匹配，准确度为84.43%，敏感度为78.01%，特异度为91.97%[25]。以上均提示患者来源的肿瘤类器官有预测肿瘤患者化疗、放疗及靶向治疗等反应的潜能。患者来源的肿瘤类器官能否准确反映患者的临床反应还需要更多的队列研究来验证。一项包含了转移性结直肠癌、乳腺癌和非小细胞肺癌的大规模前瞻性观察队列研究（NL49002.031.14）在荷兰癌症研究所开展[26]，这将为研究者们更客观看待类器官在肿瘤药物筛选和预测患者治疗反应等精准治疗中的作用提供依据。

2 类器官在基础肿瘤学研究中的应用

2.1 利用类器官进行大规模的抗癌药物研发传统的实验室肿瘤药物研发首先是在2D 体外模型（如肿瘤细胞系）中观察药物处理对癌细胞增殖的影响，大批量地筛选新型抗癌药物，确定潜在的抗癌药物后，研究通常需要过渡到PDX 模型，研究药物在体内模型中的药效及安全性[27-28]。事实上，进入肿瘤临床试验的临床前药物大约85%未能表现出在筛选阶段体现的安全性和有效性[29]。这一数字提示既往肿瘤药物筛选模型的局限性：2D 肿瘤细胞系在体外选择性培养环境中无法保留原肿瘤遗传特性及相应的肿瘤微环境[1，4]。Dhimolea 等[30]研究发现，相较于肿瘤类器官，体外培养的2D 肿瘤细胞对药物的耐受性较低，在同剂量的化疗药物处理下，2D 肿瘤细胞更早出现凋亡，在同样的处理时间下，2D 肿瘤细胞的存活率也更低，这样的实验结果提示类器官的3D 结构会影响体外肿瘤药物敏感性的检测。虽然具有肿瘤3D结构的PDX 模型对肿瘤有代表性，但其培养周期及检测效应期较长，常用的PDX 模型药物敏感性检测指标（如异种移植物大小或小鼠生存时间等）不适于高通量检测[22-23]，因此，需要一个能更好复制人类肿瘤复杂性且适用于高通量检测的肿瘤模型来进行药物筛选。多项前期研究提示，在临床前应用中，肿瘤类器官模型的药物敏感性检测与配对患者的一致性较高[14，16，18，20-21]。Vlachogiannis 等[31]对71 例转移性结直肠癌进行类器官培养和体外药物敏感性检测，匹配体外实验结果和患者临床治疗反应显示体外类器官药物敏感性能达到100%的敏感度和93%的特异度。

利用类器官进行药物敏感性检测时，多数研究采用对经药物处理后的类器官进行细胞活力检测的方法，计算半抑制浓度（IC50）和曲线下面积，评估类器官对药物是否敏感[13-14，16，18，20-21]。还有研究将经药物处理后的类器官注入免疫缺陷小鼠体循环/肾囊下，通过观察形成的患者来源类器官异种移植物（patient derived organoids xenografts，PDOX）体积、转移和生存情况等来评价药效[31]。为了更有效地筛选药物，Jabs 等[32]为卵巢癌类器官开发了一种基于自动显微镜的DeathPro 分析法，一方面，该分析法利用不同的染色方法将活细胞与死细胞分开，并在连续的时间点通过共聚焦显微镜分析死细胞（PI 染色）和所有细胞（Hoechst 染色）覆盖的总面积，并计算半数致死浓度（LD50）、细胞死亡曲线下面积（area under curve values for cell death）和增殖抑制情况。另一方面，合并健康组织的类器官培养，如肝脏和肾脏类器官，在检测药物对肿瘤细胞的作用时，可观察同种药物对正常肝脏、肾脏类器官的影响，从而辅助筛选专门针对肿瘤细胞而不会伤害健康细胞的抗癌药物，这能帮助发现潜在的药物不良反应[33]。直接来源于患者的肿瘤类器官模型结合高通量技术应用于大规模药物筛选是医学迈向个体化精准医疗的重要里程碑。

2.2 类器官在肿瘤发生发展机制的研究结合CRISPR/Cas9 介导的基因编辑技术可以在类器官中研究基因的生物学功能。已有实验室将常见的结肠癌基因突变引入培养中的人肠道干细胞或源自正常人肠上皮的类器官，包括KRAS、APC、TP53、SMAD4和PIK3CA 基因[34-35]。上述研究中，在敲除了APC 和TP53 基因的人肠道干细胞发育成的类器官中发现了大量非整倍体异形细胞[34]，将经过基因编辑的类器官移植到免疫缺陷小鼠中，发现类器官在小鼠体内发展为腺癌。这提示APC 和TP53 基因突变在结直肠癌发生过程中具有驱动作用。而在小鼠的肾脏包囊下植入同样经过基因编辑的类器官后能形成肿瘤，但未能形成转移灶，提示肿瘤侵袭行为可能需要另外的基因参与[35]。上述研究展示了类器官结合基因编辑技术对研究驱动肿瘤发生、发展的基因的潜能。除此之外，基于类器官体外培养、操作方便的特性，还可建立病毒感染类器官模型，通过共培养系统模拟病毒-肿瘤的关系，如肝炎病毒与肝癌、EB 病毒与鼻咽癌。在类器官模型上模拟从感染到肿瘤形成的过程可能有助于揭示病毒的致癌机制，并在此过程中找到潜在的抗肿瘤靶标。

2.3 肿瘤类器官整合微环境研究探究细胞与细胞、细胞与细胞外基质等肿瘤微环境内组分相互作用已逐渐成为肿瘤研究热点，但却缺乏合适的体外肿瘤微环境模型。在胰腺癌体外模型研究中，有团队结合类器官培养方法和流式细胞术开发表征患者胰腺癌类器官和肿瘤微环境的多细胞器官样共培养模型[36]，该模型包含肿瘤细胞、成纤维细胞和免疫细胞等肿瘤组分，从一定程度上在体外反映了肿瘤与其周围微环境的相互作用。Neal 等[37]的研究利用气液界面（air-liquid interface，ALI）培养法直接培养患者来源的肿瘤组织，利用免疫荧光、流式细胞术和单细胞测序等手段验证时发现，肺癌、肾癌和黑色素瘤等肿瘤来源的类器官均能维持原肿瘤的肿瘤微环境组分（成纤维细胞基质及免疫细胞种群）。结合此类类器官中保留的原肿瘤免疫组分的特点，可在体外模拟肿瘤免疫治疗。加入纳武单抗（nivolumab）可激活类器官中的T 细胞，进而诱导T 细胞的肿瘤细胞杀伤作用，在体外检测患者类器官对免疫检查点抑制剂的敏感性，推进个体化免疫治疗的发展[37]。整合肿瘤微环境的类器官共培养模型将为体外研究肿瘤免疫逃逸、肿瘤免疫治疗等多种方向提供助力。

3 结语与展望

类器官在肿瘤研究中具有不可替代的优势，特别是患者来源的类器官。多项研究表明患者来源的肿瘤类器官可完整模拟原肿瘤组织结构和遗传特性，在精准治疗中作为临床前模型，预测疾病预后及指导患者治疗。然而目前的类器官培养仍存在一些缺点，如无法批量生产、组分单一等。规范类器官的培养技术及降低类器官培养成本，实现类器官上高通量药物筛选，更好地整合类器官与血管、神经和免疫等组分以构建完整的肿瘤微环境体系，这些都将是类器官领域未来的发展方向。