中性粒细胞NETs介导类风湿关节炎疾病的进展研究

刘轩绮，刘汇洋，霍银萍，白 力，王永福

(内蒙古科技大学包头医学院第一附属医院中心实验室，内蒙古 包头 014010)

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种全身性自身免疫性疾病，该病的全球患病率约0.5 %～1.0 %，不同人群之间的差异很大[1]。其特征是关节受累，伴有进行性软骨和骨破坏，除关节受累外，还可伴有关节外器官受累，如血管炎、结节、眼病和间质性肺病等，其中以肺受累最为严重。遗传和环境因素均参与RA发病机制，目前RA的病因尚不完全清楚。

在RA的早期阶段，中性粒细胞大量浸润关节腔，积聚于滑膜组织和液体中。滑膜区中性粒细胞的存在与关节炎症的早期临床表现相关，提示中性粒细胞在RA的启动中起重要作用[2]。在炎症性疾病中，当中性粒细胞被细胞因子、趋化因子和自身抗体不恰当地激活时[3]，可释放中性粒细胞外捕获网(neutrophil extratrapping networks，NETs)提供自身抗原的来源[4]，并产生活性氧(reactive oxygen species,ROS)[5]。

中性粒细胞NETs的形成过程(NETosis)与RA疾病的进展密切相关[6]，研究发现，RA外周血和滑膜液中性粒细胞中的NETosis增强[7]，此外，NETs可放大RA患者滑膜中的有害炎症反应[8]。NETs已被证实可加速RA疾病的进展[9],鉴于RA对NETs的高特异性(92 %)和敏感性(91 %)[10]，NETs可作为RA早期诊断的一种潜在的新型生物标志物。

本研究探索下调中性粒细胞能否缓解胶原诱导关节炎(collagen induced arthritis，CIA)小鼠模型疾病程度，同时结合测序分析RA患者NETs形成后的转录组差异，为关于NETs影响RA疾病进展的后续研究提供一定的理论基础。

1 对象与方法

1.1动物与试剂 雄性DBA1小鼠(8周龄)购自南京大学动物模型研究中心。CIA造模成功后将小鼠随机分为2组，5只/组。WT组：即未经任何处理的DBA1小鼠，CIA组：即胶原诱导的CIA小鼠；Anti-Ly6G组：即注射anti-Ly6G药物的CIA小鼠。鼠抗Gr-1(Ly6G/Ly6C)单克隆抗体购于BioXCell公司，EasySepTM人类中性粒细胞分选试剂盒购于STEMCELL公司，抗瓜氨酸H3抗体和FITC荧光二抗购于Abcam公司，DAPI购于Invitrogen公司。牛二型胶原蛋白(CⅡ)和弗氏完全佐剂(CFA)购自Chondrex(美国华盛顿州雷德蒙德)。

1.2小鼠实验

1.2.1CIA造模 本研究严格按照CIA小鼠建立模型标准化原则进行。(1)将7.605 mL去离子水中加入45 μL冰乙酸，稀释为本实验所需最终浓度0.1 mol/L，随后取7.5 mL混合液，加入牛Ⅱ型胶原，吹打至完全溶解，配制为2 mg/mL，置4 ℃冰箱中过夜备用；(2)用2 mL螺口注射器，将7.5 mL的牛Ⅱ型胶原与7.5 mL完全弗氏佐剂置于冰上混合乳化；(3)判断乳化成功与否：将乳化好的胶原滴一滴在水面上，液滴不散，且边缘隆起，说明乳化成功；如果液滴分散，且边缘扁平，则乳化不成功，继续在冰上乳化；(4)用1 mL螺口注射器，于距小鼠尾根部2 cm处进针，行皮内注射，每只小鼠注射100 μL乳化成功的胶原和完全弗氏佐剂混合物；(5)21 d后进行第2次免疫，步骤同第1次免疫；(6)28 d小鼠的关节会出现红肿，即造模成功。

1.2.2中性粒细胞敲减实验 DBA1鼠加强免疫后，对CIA小鼠以10 μg/g的剂量进行腹腔内注射抗LY6G单克隆抗体，1次/周，连续4周。

1.2.3组织学染色 在第4周末处死小鼠，收集小鼠肺及脾组织，进行苏木素-伊红染色(HE染色)评估。分离小鼠后肢，并将关节固定于福尔马林中，对标本进行石蜡包埋，番红固绿染色，根据滑膜组织中炎性细胞浸润数量、蛋白多糖损失的程度以及关节软骨破坏、骨侵蚀的程度对关节的组织病理学变化进行评估。

1.3测序 收集4名包头市包头医学院第一附属医院风湿免疫科RA患者，纳入标准：遵循1987年美国风湿病学会(ACR)分类标准；参与本实验的患者充分了解该研究的实验原理及目的，自愿参加本研究。本实验所有参与者均签署了知情同意书，同时，本项课题相关研究经过我校伦理委员会的批准。采集2 mL RA患者静脉血，于枸橼酸钠抗凝管或EDTA抗凝管中，充分混匀。利用EasySepTM人类中性粒细胞分选试剂盒采集RA患者外周血中性粒细胞(磁珠分选)。弃上清，沉淀中加入1 mL Trizol，标记对照组(RA_control)与刺激组(RA_PMA)，细胞在液氮中快速冷冻，送至华大公司进行基因测序，将测序结果通过R软件“DESeq2”包进行差异基因筛选。

1.4免疫荧光染色

1.4.1基础步骤 取200 μL 0.01 %多聚赖氨酸均匀涂于培养底物的表面，将磁珠分选法得到的RA外周血中性粒细胞离心移至培养板中，随后加入4 %多聚甲醛固定15 min，继续加入0.5 % Triton室温静置15 min，最后用1 % BSA室温封闭30 min，加入配制好的一抗避光孵育过夜后，隔日孵育二抗及DAPI染料，倒置显微镜下观察。

1.4.2浓度梯度实验 利用磁珠分选法收集RA患者外周血中性粒细胞，加入佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯(phorbol-12-myristate-13-acetate，PMA)刺激中性粒细胞产生NETs，分别用8 nmol/L、16 nmol/L、24 nmol/L、32 nmol/L PMA刺激24孔板中1.5×106中性粒细胞悬液，放置于5 %二氧化碳培养箱孵育2 h，弃去培养基，PBS漂洗2～3次，5 min/次，荧光倒置显微镜观察NETs形成情况。

2 结果

2.1中性粒细胞下调影响CIA小鼠疾病进展 番红固绿染色显示，相较于WT组，CIA组小鼠关节软骨层完整性破坏，软骨细胞分布紊乱，关节间隙变狭窄；Anti-Ly6G组小鼠较CIA组的骨破坏程度有所缓解。见图1。

图1 中性粒细胞敲减对CIA小鼠滑膜关节组织的影响

与WT组相比，CIA组小鼠肺泡间隙增大，出现大范围的断裂；敲减中性粒细胞组(Anti-Ly6G组)肺泡间隙较CIA组变小，肺病理变化有所改善。见图2。

图2 中性粒细胞敲减对CIA小鼠肺组织的影响

WT组小鼠脾脏结构完整，红髓和白髓之间界限清晰，脾小梁形态和数量正常，细胞分布均匀致密；CIA组小鼠脾脏结构破坏明显，红髓缩小，脾窦区扩张，脾小梁数量明显减少；与CIA组相比，Anti-Ly6G组小鼠脾脏结构破坏缓解，红髓相对变大，脾小梁数量有所增加，脾脏病理变化均有所改善。见图3。

图3 中性粒细胞敲减对CIA小鼠脾脏的影响

2.2中性粒细胞形态特征 利用磁珠分选法分离RA患者外周血中性粒细胞后进行培养，利用DAPI染色，荧光显微镜下观察到绝大多数为分叶核的中性粒细胞，具备中性粒细胞的基本形态。见图4。

图4 RA患者外周血中性粒细胞形态(40×)

2.3诱导NETs形成最佳浓度 8 nmol/L PMA刺激RA外周血中性粒细胞产生NETs典型的纤维网状结构，16 nmol/L、24 nmol/L、32 nmol/L PMA刺激产生纤维网状结构交错、呈云雾状。因此8 nmol/L PMA刺激RA外周血中性粒细胞产生NETs效果最好。见图5。

图5 PMA诱导RA患者外周血中性粒细胞NETs的情况(10×)

2.4RA-NETs存在转录组差异 将测序结果通过R语言“DESeq2”包进行差异基因筛选，对照组和刺激组筛选得到2 742个差异基因(P≤0.05)，其中包括1 579个上调差异基因[log2(RA_control/RA_PMA>0)]和1 163个下调差异基因[log2(RA_control/RA_PMA<0]。见图6。

图6 RA中性粒细胞NETs差异基因火山图及热图

为筛选出差异倍数更显著的差异基因，将差异倍数定为-2≥log2(RA_control/RA_PMA)≥2，筛选出340个差异基因。将符合条件的差异基因绘制PPI图(图7)，随后进行GO和KEGG富集分析，GO分析结果如图8A-C所示，分子功能中意义最显著的为细胞因子活性、趋化因子活性、蛋白绑定和CCR趋化因子受体绑定(图8A)；细胞组分中意义最显著的为细胞外区和细胞外空间(图8B)；生物过程中意义最显著的为免疫回应和信号受体活性的调控(图8C)。KEGG分析结果如图8D所示，富集最显著的通路为细胞因子之间相互调控通路。为进一步探索340个差异基因富集的具体关系，利用GSEA软件中C2 KEGG数据集对刺激组的高低表达基因进行基因富集对比，基因组筛选标准为P<0.05，结果如图8E-G所示，GSEA分析得到大多数与刺激组呈正相关的富集基因组位于细胞因子受体互作、凋亡和Toll样受体信号通路中。

图7 差异基因PPI网络

图8 差异基因的GO、KEGG以及GSEA分析

3 讨论

中性粒细胞是炎症发生早期首先进入炎症部位的免疫细胞。在RA早期，中性粒细胞迁移到关节腔内，并在RA滑膜炎症过程中发挥功能，加重RA的骨破坏，介导RA疾病进展[11]。中性粒细胞在活动性疾病患者炎症关节中的免疫细胞中通常占最大比例[12]。研究发现，PMN计数高的RA患者生存期短[13]，Wang等[14]证实基于外周血中性粒细胞为载体的制剂对RA起到有效的抗炎作用。本研究通过构建CIA小鼠模型，对小鼠中性粒细胞进行干预敲减发现，CIA小鼠中性粒细胞敲减使关节间隙相对CIA组变窄，软骨受损程度减轻；小鼠的肺、脾组织病变程度有所缓解，证实了中性粒细胞敲减后，CIA疾病状态部分减轻。

NETs是中性粒细胞外捕获网结构，当中性粒细胞遇到体积大、数量多、超过中性粒细胞快速处理能力的外来病原微生物感染时，中性粒细胞会启动自身NETs[15]。大量学者提出可将NETs作为靶点研发RA的新型治疗手段[16]，但NETs影响RA进展的具体机制尚未完全清晰。本研究通过体外收集人外周血中性粒细胞，进行DAPI染色，证实了本实验收集的细胞符合中性粒细胞基本形态。为进一步探究中性粒细胞NETs在RA发病中的作用，首先通过诱导RA NETs实验确定了诱导物PMA刺激中性粒细胞产生NETs的最佳浓度为8 nmol/L，随后通过对RA中性粒细胞进行测序，同时设置组别为RA_contro组和RA_PMA组，对两组进行差异分析，发现340个基因具有差异性。将340个差异基因绘制PPI图，展示了它们之间的相关性，并对其进行了KEGG富集分析以及GSEA分析。我们发现340个差异基因主要富集在细胞因子受体互作、凋亡和Toll样受体信号通路中。

细胞因子是一种存在于细胞外的小分子多肽，参与调节免疫细胞分化发育、调节免疫应答、介导炎症反应等生理活动，在细胞信号转导过程中发挥着重要作用。在RA发病过程中，细胞因子是炎症、组织损伤以及免疫反应的主要介质。研究表明，细胞因子可促进NETs的产生，同时NETs可降解细胞因子，从而减轻炎症[17]。细胞凋亡发生于许多生物体生理变化过程中，是一种受严格调控的能量依赖性的程序性死亡。自噬也是维持细胞稳态的关键机制，是形成NETs的先决条件之一，自噬被抑制会阻碍NETosis的进程[18]。同时，在RA中Toll样受体信号通路通过激活核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)和Janus激酶信号传导子和转录激活子(Janus kinase signal transducers and activators of transcription,JAK-STAT)信号通路导致炎症进行性发生，引起滑膜增生和软骨的侵蚀[19]，且NETs可通过Toll样受体激活炎症，触发静脉血栓形成。本研究通过生物信息学结果证实NETs的形成与以上的免疫过程相关性高，表明NETs的形成可能通过以上的免疫过程对RA疾病进展起到作用。

综上所述，下调中性粒细胞可缓解CIA小鼠疾病关节滑膜、肺及脾的病理改变，RA的NETs形成与免疫调控、凋亡以及细胞因子之间相互作用、凋亡和Toll样受体信号通路相关，表明NETs的形成可能参与以上免疫过程，对RA疾病进展起重要的作用。未来我们可以通过研究RA患者NETs与这些通路之间的相关性，探索NETs介导RA疾病发展的可能机制。