环氧合酶-2抑制剂对佐剂性关节炎大鼠胃黏膜的影响*

贺 清，丁瑞峰，黎 敏，陈 楠，吴 昆，张爱民

(内蒙古科技大学包头医学院第一附属医院，内蒙古 包头 014010)

选择性环氧合酶-2(Cyclooxygenase 2，COX-2)抑制剂塞来昔布是一种新型非甾体抗炎药(Nonsteroidal anti-inflammatory drug，NSAIDs),其对COX-2受体有较高的选择性，疗效与传统NSAIDs相当且不良反应少[1]。然而有研究发现在关节炎大鼠中单次大剂量应用塞来昔布(100 mg/kg)会出现类似于传统NSAIDs胃黏膜损伤[2]，在使用塞来昔布治疗的关节炎患者中，胃肠道不良事件发生率为0.34 %，布洛芬和萘普生的分别为0.74 %和0.66 %[3]。目前选择性COX-2抑制剂的安全性仍具有争议。类风湿性关节炎的动物模型在人类疗效的可预测性方面已得到证实[4]，因此本实验通过建立佐剂性关节炎大鼠模型，给予治疗量的塞来昔布灌胃，探究其是否加重佐剂性关节炎大鼠胃黏膜损伤及机制，为临床安全用药提供基础研究依据。

1 材料与方法

1.1实验动物与分组方法 SPF级成年雄性SD大鼠32只,体质量500～600 g，日龄210～240 d,由北京斯贝福生物技术有限公司提供[实验动物机构许可证号:SCXK(京)2019-0010]。饲养温度20～25 ℃，湿度50 %～70 %，光照周期12 h，喂食标准的食物和水。大鼠适应性饲养1周后，按照体质量分层原则随机分为4组，每组8只，分别为A组空白对照组(正常大鼠+甲基纤维素)、B组关节炎对照组(关节炎大鼠+甲基纤维素)、C组正常给药组(正常大鼠+塞来昔布)、D组关节炎给药组(关节炎大鼠+塞来昔布)。每天至少对动物的健康进行2次评估，对发生与实验无关不良反应的大鼠给予过量水合氯醛处死。实验操作流程符合《实验动物管理和使用指南》的规定，遵循包头医学院第一附属医院动物伦理操作规范。

1.2主要试剂及仪器 塞来昔布胶囊(美国辉瑞公司，国药准字J20140072，批号AL5873)；弗氏完全佐剂(美国Sigma公司，型号F5881-10 mL，批号SLCB4664)；甲基纤维素(美国Sigma公司，型号V900506-250G，批号WXBD00S9V)；显微镜(Olympus，型号 CX23)、包埋机(武汉俊杰电子有限公司，型号JB-P7)、石蜡切片机(中国金华科迪，型号KD-3358)。

1.3佐剂性关节炎模型的制备 模型组(B、D)通过右足底皮下注射完全弗氏佐剂200 μL建立类风湿关节炎大鼠模型，对照组(A、C)给予相同剂量生理盐水。相较于对照组大鼠而言，造模3 d后的模型组大鼠右后足跖部明显肿胀，皮温明显升高，7 d后继发性炎性反应，表现为耳廓、足趾关节、踝关节不同程度地发红、肿胀，活动受限，提示造模成功。

1.4实验方法 造模1周后开始给予塞来昔布(20 mg/kg，溶于1 %甲基纤维素中，灌胃容积5 mL/kg)，灌胃28 d，对照组给予相同剂量甲基纤维素，药物均现用现配。实验第42 d开始禁食36 h后，10 %水合氯醛0.1 mL/100 mg腹腔注射麻醉处死全部大鼠，取胃组织，用PBS液冲洗干净。

1.5胃组织病理学观察 从幽门部沿胃大弯剪开，取1 cm×1 cm胃标本置4 %多聚甲醛固定，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，常规病理切片，HE染色，光学显微镜观察。由专人盲法阅片，每个样本随机计数 20个视野，对每个视野按标准进行单独评分，取20个视野最后平均数为最终病理评分。胃黏膜损伤病理评分标准[5]：显微镜下观察胃组织切片1 cm 范围，上皮细胞及或腺体破坏，计1分；上层黏膜充血或水肿，计2分；中、下层黏膜充血、出血性损害，计3分；深层坏死或溃疡形成，计4分；计算每张切片的累积评分。

1.6胃组织大体观察 从幽门部沿胃大弯剪开，将胃组织平铺于纱布上, 观察胃大体损伤。参考Guth标准[6]，以游标卡尺测定，计分：0分(正常)；1分(斑点糜烂)；2分(糜烂长度<1 mm)；3分(糜烂长度1～2 mm)；4分(糜烂长度2～3 mm)；5分(糜烂长度> 3 mm)。宽度> 1 mm时分值乘以2，各分值累计相加为损伤总分值。

1.7统计学处理 采用SPSS 24.0统计软件进行数据分析。变量各组间不满足正态分布和方差齐性要求，整体差异性检验采用Kruskal-Wallis检验，组间两两比较采用Nemenyi检验；数值采用M[P25，P75]表示，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1大鼠的一般情况 空白对照组大鼠饮食、活动、大便如常。模型组(B、D)造模后第3 d开始出现右后足红肿、皮温升高、关节肿胀、变形，第7 d达到高峰，第14 d出现对侧后足肿胀，右后足关节僵硬变形，皮下结节多而明显。用药后关节炎给药组右后足周径逐渐下降，给药第2 d关节炎给药组部分出现少动、易激，部分毛发失去光泽，无明显食欲下降等。

2.2胃黏膜病理组织学观察及评分 胃黏膜HE染色示：空白对照组大鼠胃黏膜结构完整，胃小凹和腺体清晰，未见明显损伤及炎症反应；关节炎对照组大鼠胃黏膜上皮脱落，血管扩张；正常给药组大鼠胃黏膜出现轻度黏膜脱落，范围较小；关节炎给药组大鼠胃黏膜出现深层黏膜损伤，血管扩张。关节炎给药组胃黏膜损伤评分较空白对照组、正常给药组明显增加，但与关节炎对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见图1，表1。

表1 各组大鼠胃病理评分结果

图1 各处理组胃病理照片(HE染色 ×400)

2.3胃大体损伤评分 空白对照组、正常给药组大鼠未见明显胃损伤，而关节炎对照组、关节炎给药组可观察到多处点状胃糜烂。关节炎给药组大鼠胃大体损伤评分较空白对照组、正常给药组明显增加，但与关节炎对照组无显著差异。见表2。

表2 各组大鼠胃大体损伤评分结果

3 讨论

选择性COX-2抑制剂，通过保留具有保护性的COX-1，同时抑制具有促炎性的COX-2而在发挥抗炎、镇痛等作用的同时避免胃黏膜损伤。本研究发现正常给药组虽较空白对照组出现了部分胃黏膜轻度脱落，但范围较小且两组病理评分以及大体损伤评分差异无统计学意义，这表明治疗剂量下塞来昔布对健康大鼠的胃黏膜几乎无损害作用，Kato等[2]的研究中也证明了这一点。Silverstein等[7]研究表明选择性COX-2抑制剂已安全地用于健康人且不会引起胃黏膜损伤。关节炎对照组与正常对照组相比病理评分、大体损伤评分均明显增加，这可能是由于关节炎引起的全身慢性炎症所致。类风湿关节炎是一种全身性自身免疫性疾病[8]，刘健等[9]研究发现佐剂性关节炎大鼠胃黏膜细胞超微结构发生了改变，表现为线粒体肿胀变性，棘突破坏或消失，细胞凋亡率高于正常大鼠，这可能是关节炎大鼠胃黏膜损伤的原因之一。Kato等[2]表明COX-2主要在关节炎大鼠胃黏膜巨噬细胞中表达，并且胃黏膜血管通透性较正常大鼠的有所增加，关节炎大鼠本身患有慢性全身炎症，胃黏膜中COX-2的表达和巨噬细胞数量的增加可能与此有关。PGE2通过增加胃黏膜微血管血流量和黏液分泌、抑制白细胞粘附血管内皮等参与消化道黏膜微循环的调节和损伤的修复[10]，Takeuchi等[11]指出PGE2通过上调血管内皮生长因子(VEGF)表达和激活EP4受体刺激血管生成，对胃黏膜损伤有促进愈合的作用。血管生成是愈合过程的关键，受促血管生成因子(如VEGF)和抗血管生成因子(如内皮抑素)的调节，这种情况在类风湿性关节炎[12]和实验性溃疡[13]愈合中均存在。因此我们推测PGE2在维持胃黏膜的完整性起到了关键性作用，关节炎黏膜局部PGE2减少，内皮抑素与VEGF的比值增加，也会使损伤的胃黏膜愈合过程受到限制。Kato等[2]通过对自身免疫性疾病的诱导较敏感的DA大鼠建立关节炎模型，发现单次大剂量使用塞来昔布(100 mg/kg)虽在正常大鼠中不会造成胃黏膜损伤，但在关节炎大鼠中确实会造成类似于传统NSAIDs药物的胃黏膜受损。而我们观察到应用治疗剂量塞来昔布[20 mg/(kg·d)，28 d]的SD关节炎大鼠，虽然出现了黏膜深层损伤，血管扩张，但其病理评分、大体损伤评分与关节炎对照组相比差异无统计学意义，证明塞来昔布并不会加重关节炎所致的胃黏膜损伤，这与Blackler等[14]的研究一致，他们发现接受塞来昔布(10 mg/kg，2次/d，14d)灌胃的关节炎大鼠其胃黏膜损伤程度可以忽略不计。我们推测，这些损伤差异可能与药物具体的种类、剂量、用药时间、实验鼠种等有一定的关系。

总之，塞来昔布不会造成正常大鼠胃黏膜损伤，也不会加重关节炎大鼠胃黏膜损伤，在考虑整个胃肠道的安全性时，目前研究支持使用“昔布类”而不是传统NSAIDs。然而，使用该药物应与心血管疾病风险相平衡，尤其是在心血管疾病高风险患者中。必要时，应规定传统NSAID或“昔布类”的最短持续时间和最低有效剂量[15]。