液体活检在肝细胞肝癌早期筛查中的作用及研究进展

姜绍文 谢青

根据2020年12月WHO发布的全球最新癌症负担数据，原发性肝癌是发病率居第6位的恶性肿瘤，而其死亡率更是高居第3位[1]。WHO估计2030年全球将有超过100万人死于原发性肝癌，而肝细胞肝癌(HCC)是原发性肝癌最常见的病理类型，约占所有原发性肝癌的85%[2]。我国是肝病大国，HCC发病率和死亡率均占全球的一半左右，疾病负担极为沉重[3]。HCC起病隐匿、进展迅速，大多数患者在首次确诊时已处于疾病中晚期，失去了根治的机会，远期预后差。而早期筛查、早期诊断、早期治疗对于改善HCC患者预后、提高根治率和长期生存率至关重要。令人沮丧的是，我国大陆地区早期HCC[巴塞罗那临床肝癌分期(BCLC) 0/A期]的诊断构成比仅为33%，总体生存期23个月，5年生存率仅11.7%～14.1%[3]。目前临床上HCC的早期筛查主要依赖于腹部超声检查联合外周血清标志物[如甲胎蛋白(AFP)、异常凝血酶原(DCP/PIVKA-Ⅱ)等]检测。然而这些单一的血清学标志物即使联合超声检查，诊断早期HCC的能力仍无法令人满意，发现小肝癌(直径≤2 cm)的敏感度更有较大改善空间。因此，临床急需敏感度和特异度更高的、便于反复检测、动态监测的新型无创HCC早期筛查标志物。

液体活检指对外周循环中的肿瘤副产物进行分子生物学分析，以获取原发肿瘤相关信息的技术，包括外周血、尿液、胸腔积液、腹腔积液等体液中的循环肿瘤细胞(CTCs)、循环肿瘤DNA(ctDNA)、循环游离RNA(cfRNA)及外泌体等成分[4]。液体活检在肺癌、结直肠癌、前列腺癌和乳腺癌等肿瘤中的研究已显示其具有良好的临床应用前景[5]。近年来，HCC领域内有关液体活检的研究也逐渐增多，涵盖HCC的早期筛查和诊断、预后评估、疾病进展及复发监测、疗效预测等诸多方面，成为众多学者关注的一大热点。本文对液体活检在HCC早期筛查中的作用及研究进展作一综述。

一、CTCs

CTCs由原发肿瘤或转移瘤释放进入外周血而形成。每天有大量CTCs进入血液循环，但仅少于0.01%的CTCs最终存活，并形成致命性转移灶。CTCs半衰期一般为1.0～2.4小时，大多数CTCs因免疫攻击、剪切力、失巢效应而消亡，在发生转移的肿瘤患者中CTCs仅占外周血细胞的十亿分之一，这给CTCs的研究带来巨大困难[4-5]。幸运的是，随着科学技术的不断进步，鉴别、分离、分析CTCs特征的方法学也取得一定突破。目前检测CTCs的平台主要基于CTCs的物理特性(如密度、电荷、变形能力)或生物学特性(主要为细胞表面的各种标志物)，而CellSearchTM是唯一通过美国食品药品监督管理局认证的CTCs检测系统[4-5]。该系统主要利用CTCs表面的上皮细胞粘附分子(EpCAM)对其进行识别和检测，但HCC患者中EpCAM阳性率较低，再加上存在上皮间质转化(EMT)过程，因此该方法可能低估CTCs的实际数量[5-6]。

一项大型临床研究检测受试者(HCC和肝硬化/慢性乙型肝炎+健康对照)外周血中肿瘤相关基因的定量表达，构建了源于CTCs的聚合酶链反应(PCR)评分用于HCC患者的诊断[7]。此研究证明该评分诊断HCC的效力高于AFP(截断值为20 ng/ml)：CTC-PCR评分诊断HCC的敏感度为72.5%，特异度为95%，受试者工作特征曲线下面积(AUC)为0.88，而该队列中AFP诊断HCC的敏感度为57%，特异度为90%，AUC为0.77。此外，该评分诊断早期HCC的表现同样可观：BCLC 0期对应的AUC为0.92，BCLC A期对应的AUC为0.86。同时，也有研究发现CTCs联合AFP可进一步提高诊断HCC的能力：AFP以400 ng/ml为截断值区分慢性肝病和HCC的AUC为0.67，CTCs对应的AUC为0.77，而二者联合之后的AUC被提高至0.82[6]。但总体而言，鉴于CTCs在患者外周血中的数量极少，且与原发肿瘤负荷呈正相关，CTCs在HCC早期筛查、早期诊断方面的应用存在较大挑战，更多的研究支持CTCs用于HCC的预后预测及疾病进展、术后复发的动态监测[8]。

二、ctDNA

谈及ctDNA，不可避免地要先提到细胞游离DNA(cfDNA)。cfDNA长度约160～180 bp，主要源于循环中的淋巴细胞和其他死亡的良性宿主细胞。ctDNA则是特指源于坏死和凋亡的肿瘤细胞的DNA片段，在cfDNA中只占很小一部分[5]。目前的技术从cfDNA中分离ctDNA仍存在困难。ctDNA检测技术可分为靶向(如PCR)和非靶向技术(如全基因组测序)，前者对已知的特定基因敏感度高，后者可提供更为全面、综合的遗传信息[9]。因ctDNA包含与原发肿瘤相同的遗传学改变(包括DNA甲基化、突变和拷贝数量变异)，ctDNA检测在HCC早期筛查、早期诊断方面展示出广阔的应用前景。

DNA甲基化改变尤其是抑癌基因CpG岛的甲基化改变，在HCC的发生发展中发挥重要作用[4]。已有大量研究表明多种不同基因的甲基化异常对HCC的诊断效力优于AFP。Xu等[10]检测HCC患者和健康对照者外周血ctDNA特定位点的甲基化水平，开发了一个基于10个甲基化基因的HCC诊断模型，其在验证集中检出HCC的敏感度和特异度分别为83.3%、90.5%，AUC达0.944。另一项由HOXA1、EMX1、ECE1、AK055957、PFKP和CLEC11A等6个异常甲基化基因构成的诊断模型，经不同临床队列多期验证，被证明可实现极高的HCC诊断效力：敏感度为95%，特异度为92%，AUC为0.96[11]。此外，也有研究报道5-羟甲基胞嘧啶(5-hmC)检测技术在早期HCC诊断中也有着不错的表现。Cai等[12]通过基于cfDNA全基因组5-hmC检测数据开发并验证了一个HCC诊断模型，其区分慢性肝病和早期HCC的AUC为0.85，明显优于AFP(AUC为0.69)。

基因编码区突变可致转录过程异常，最终可能引起蛋白质序列改变及肿瘤发生，这为基因突变检测用于HCC筛查提供了理论基础[9]。但因肿瘤早期ctDNA入血含量低，且HCC驱动基因不明、异质性高，使基于ctDNA突变检测的方法筛查早期HCC的可行性面临挑战，故研究中一般将其与蛋白标志物联合以提高诊断效能。2018年Cohen等[13]通过建立“CancerSEEK”的方法分析包括肝癌(HCC和肝内胆管细胞癌)在内的多种肿瘤的16个高频突变基因，同时检测了8种蛋白标志物，能够有效地从对照组中识别肿瘤患者。CancerSEEK对其中44例肝癌的敏感度和特异度分别为97%和60%，对其中5例早期肝癌的敏感度为100%。2019年，一项基于社区人群的大型前瞻性研究通过联合cfDNA的体细胞突变、HBV整合、cfDNA浓度及AFP、DCP与性别、年龄等多种因素开发了一个名为“HCCscreen”的液体活检方法[14]。研究中将HBsAg阳性、AFP>20 ng/ml或(和)超声检测到肝脏可疑结节，但增强MRI/CT未诊断为HCC的人群定义为高危人群。在此类高危人群组成的训练集中，HCCscreen显示了良好的诊断效力(敏感度为85%，特异度为93%，AUC为0.93)。而在331例AFP正常、超声未见可疑结节的HBsAg阳性患者组成的验证集中，该模型成功识别出全部4例HCC患者，且4例均为肿瘤早期(结节直径<3 cm)，诊断敏感度为100%，特异度为94%。

此外，全基因组测序/二代测序技术为我们提供了更加全面、综合的cfDNA特征谱，可进一步提高HCC的检出率。2022年，Zhang等[15]通过全基因组测序获取外周血浆中cfDNA的片段大小分布特征，经生物信息学处理构建了肝恶性肿瘤的诊断模型。在189例肝恶性肿瘤(绝大部分为HCC)和164例非肿瘤对照组成的验证集中，该模型识别出肝恶性肿瘤的敏感度为96.8%，特异度为98.8%，AUC高达0.995。其对早期HCC的诊断同样出色，对应的敏感度为96.2%。除cfDNA片段大小分布，全基因组测序技术还可提供拷贝数变异、核小体印记、末端序列等更为丰富的特征参数，多种cfDNA特征参数的联合及与cfDNA甲基化、蛋白标志物的联合，也成为探索更精准的HCC诊断模型的新方向。Chen等[16]在一个来自中国11个省份13家医院、合计3 204例受试者的大型队列中，基于全基因组测序和5-hmC检测技术构建了多组学多维度的HIFI评分系统，系统内包括5-hmC、末端序列、片段分布、核小体印记等多个参数，其区分HCC和非HCC的敏感度达95.42%，特异度达97.83%，AUC高达0.996。值得一提的是，对于AFP或DCP阴性的患者，HIFI的敏感度也高达90.9%～96.9%，可有效降低HCC的临床漏诊率；而对于极早期(BCLC 0期)和早期(BCLC A期)HCC，HIFI的检出敏感度和特异度(88.9%、94.4%)均显著优于AFP(22.2%、16.7%)及DCP(55.6%、61.1%)。

三、cfRNA

微小RNAs(miRNAs，miR)是一类由约22个核苷酸组成的内源性非编码RNA，可与靶基因结合，通过抑制转录或降解mRNA调节基因表达，是近年来研究最广泛的HCC生物标志物之一[4]。目前已有至少超过70多种miRNAs被报道可作为HCC潜在的标志物[17]。单一高水平表达的miRNAs中，似乎miR-21、miR-199和miR-122在HCC诊断中最有前景[18]，然而有研究也显示单一的miRNA诊断HCC的效力较有限，包含多种不同miRNAs的联合诊断模型能够大大提高HCC的检出率。早在2011年，Zhou等[19]就构建了一个由7种miRNAs(miR-122、miR-192、miR-21、miR-223、miR-26a、miR-27a和miR-801)组成的综合诊断模型，该模型可将HCC和健康对照、慢性乙型肝炎、肝硬化有效区分开，对应的AUC分别为0.941、0.842、0.884；其诊断效力不受HCC分期的影响，检出BCLC 0期、A期、B期和C期对应的AUC分别为0.888、0.888、0.901和0.881。基于此结果，7种miRNAs检测试剂盒已于2017年获得国家食品药品监督管理局的三类器械认证，进入临床实际应用。近年来包含不同miRNAs的综合诊断模型不断被不同的研究团队开发、验证，进一步确认了miRNAs在HCC筛查和诊断中的巨大价值。近期一项研究提出了8种miRNAs组成的新型HCC诊断模型，在HCC高危人群中识别HCC的敏感度为97.7%，特异度为94.7%，几乎所有(98%)检出的HCC患者均处于疾病早期[20]。

除miRNAs外，长链非编码RNA(lncRNAs)和环状RNAs(circRNAs)在HCC的早期筛查和诊断中也逐渐受到研究者的重视。lncRNA HULC是HCC领域内研究最多的lncRNA之一，其在HCC组织内和外周血浆中的表达水平明显高于对照组，有望成为筛查和诊断HCC的新型潜在标志物[21]。lncRNA CTBP和其他RNA组成的联合模型[22],LINC00152、XLOC014172、RP11-160H22.5和AFP组成的综合模型[23]等，都能以相当高的准确性将HCC患者和慢性肝病/肝硬化、健康对照者区分开。Li等[24]发现circSMARCA5表达水平在HCC患者血浆中明显下调，血浆circSMARCA5表达水平区分HCC和慢性肝炎、肝硬化的AUC分别为0.853、0.711，当与AFP联合后，对应的AUC可提高至0.903、0.858。最新的研究中具有HCC潜在诊断价值的circRNAs还包括hsa_circ_0000437、hsa_circ_0006091、hsa_circ_0027089等[25-27]。

四、外泌体

外泌体是一种纳米级大小的细胞外囊泡，其内容物包含RNA、DNA和蛋白质，主要负责细胞间的信息交流，在HCC的发生、发展及侵袭、转移中发挥着重要作用[5]。由于磷脂双层膜的保护，外泌体的内容物不易降解且较稳定，使其在肿瘤诊断、预后评估等方面展现出独特价值。然而相较于cfDNAs，外泌体在HCC早期筛查和诊断中的研究仍处于较为初级的阶段，有待于更多数据的验证。Cho等[28]的研究发现血清外泌体miR-10b-5p对早期HCC的诊断有较大潜力，其诊断敏感度为90.7%，特异度为75.0%，AUC为0.934。另一项研究基于机器学习，使用血浆中8种外泌体lncRNAs构建了一个“HCC分类器”，在训练集、验证集、测试集中诊断HCC的AUC分别为0.953、0.983和0.963[29]。Sun等[30]研究显示，外泌体hsa_circ_0004001、hsa_circ_0004123、hsa_circ_0075792可用于HCC的诊断,三者联合后AUC可被提高至0.89，敏感度为90.5%，特异度为78.1%。除上述外泌体非编码RNA(ncRNAs)，外泌体中的蛋白质组分也是诊断HCC的潜在标志物之一，但目前相关研究数据较少[31]。

五、挑战和展望

尽管越来越多的研究证实液体活检技术在HCC早期筛查中具有广阔的应用前景，但现阶段该技术距离真正进入临床仍面临诸多挑战：(1)液体活检包含的标志物种类众多，必然涉及到多种不同的方法学问题。从样本的采集、保存、运输到标志物的分离、检测、分析等多个环节，在不同的研究团队间尚未做到同质化、标准化，使得研究结果的可比性、重复性存疑，因此针对某一类液体活检标志物建立一个相对简易、重复性好、标准化的操作流程，对推进液体活检临床应用的最终落地意义重大。(2)虽然AFP等传统血清标志物在HCC早期筛查中的表现无法令人满意，但其成熟的检测方法、低廉的检测成本及广泛的可及性，仍然使其成为HCC早期筛查不可或缺的手段之一。目前液体活检技术需要更为专业的技术人员，检测的经济成本和时间成本明显高于AFP，这大大限制了其在临床的推广普及，故检测方法的简化、检测成本的大幅下降，也是液体活检必须跨过的一道门槛。(3)现有液体活检相关研究中报道的可用于HCC早期筛查的标志物或联合诊断模型繁多，但多来自单中心、小样本、回顾性研究，也缺少不同研究团队对同一潜在标志物的交叉验证。而某一新型诊断标志物在进入临床前必须经受住多中心、大样本、前瞻性队列研究的考验，才有可能成为一个被广泛接受的HCC早期筛查标志物。(4)HCC筛查的主要目的是发现早期HCC患者，使更多患者获得根治机会，改善长期预后。所以液体活检的研究应把重点放在尽可能地提高区分HCC和慢性肝炎/肝硬化等HCC高危人群的敏感度和特异度，尤其是对早期HCC(BCLC 0/A期)的鉴别能力方面。而先以aMAP、CAMD、PAGE-B等无创评分系统对慢性肝病患者进行HCC的风险分层，在中高风险人群中再以液体活检筛查HCC，可能进一步提高液体活检的阳性预测值，更加具有卫生经济学价值。(5)某一个或某一类液体活检标志物对HCC诊断的效能往往比较有限，多维度多组学的综合诊断模型是进一步提高早期HCC检出率的发展方向。液体活检技术完全替代目前临床常用的“AFP+腹部超声”的筛查组合可能并不现实，如何将液体活检与现行筛查手段进行有机整合，形成优势互补，是一个值得临床研究者思考的问题。(6)明确特定液体活检技术的适用人群是普适性的还是病因特异性的是液体活检走向临床实际应用前必须回答的另一个重要问题。

综上所述，相对于组织学活检，液体活检具有无创、采样简单、易于重复采样、便于实时动态监测、诊断效力明显高于传统肿瘤血清学标志物及可获得更多肿瘤生物学信息、克服HCC高度异质性等优势。虽然目前液体活检技术仍存在不少有待改进的地方，但毋庸置疑，随着科学技术的进步、方法学的改进、费用的降低及更多高质量前瞻性临床研究的验证，相信液体活检将在不久的未来进入临床实际应用阶段，在HCC的早期筛查、早期诊断中发挥至关重要的作用，极大优化我国HCC患者的临床管理，为提高HCC早期诊断率和根治率、改善患者长期预后带来福音。