新生SD大鼠心房肌细胞的原代培养及改良

汪尊冬 李蔚 曾臻 胡永胜 刘维琴

在心血管疾病的基础研究中，常用的动物模型包括动脉粥样硬化模型[1]、心房颤动模型[2]、心肌缺血模型[3]等。除动物模型外，细胞模型可以排除动物体液、神经等因素对实验的干扰，能更直观地展示疾病对心血管组织的影响。心肌细胞可分为心房肌细胞与心室肌细胞，目前被大多数学者所认可的永生型心室肌细胞为H9C2[4]，心房肌细胞系为HL-1[5]，但是HL-1 培养条件复杂，在国内市场销售较少，且售价昂贵。本研究旨在探索并改良体外原代培养心房肌细胞的方法。

1 材料与方法

1.1 实验动物

出生1～3 d 的SD 乳鼠15 只，雌雄不拘，由贵州中医药大学动物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 心房肌细胞的提取及纯化 所有操作均在超净台进行。（1）取1～3 d 的SD 乳鼠，用75%酒精浸泡约10 s；（2）采用“三指法”提捏乳鼠，用眼科剪从胸骨旁剪出约1 cm 切口，挤出心脏，放于提前预冷的D-Hank’s 溶液中；（3）清洗至溶液澄清，并去除血凝块；（4）在体视显微镜下剪除左右心耳、结缔组织、大血管及心室，保留心房组织；（5）将心房组织移入培养皿中，用0.25%胰酶覆盖心房组织，然后用封口膜将培养皿封闭，将培养皿放于4 ℃冷库消化5～6 h；（6）5～6 h 后用与0.25%胰酶消化液等体积的含10%胎牛血清的培养基终止消化，将组织剪碎成1 mm3大小；（7）将组织碎块倒入15 mL 离心管中，加入终浓度为0.1%Ⅱ型胶原酶＋0.5%BSA 消化液4 mL，放于37.5 ℃恒温水浴锅中，消化2～3 次可将组织碎块消化干净，每次 12 min，并收集上清；（8）将含细胞的消化液用等体积含10%胎牛血清的培养基终止消化，并用 200 目过滤网滤除组织碎块，收集上清；（9）将收集到的含细胞上清液离心，1 000 转/min，5 min；（10）离心后去除上清，用含10%胎牛血清的培养基吹散细胞沉淀，将含细胞的培养基移入直径 60 mm 的培养皿中，差速贴壁90 min；（11）90 min后将含细胞的培养基移入50 mL 离心管中，使用细胞计数板计数，以1×106/mL 种植细胞，种植前加入Brd U，使Brd U 终浓度为0.1 mmol/L，以抑制成纤维细胞生长；（12）36～48 h 后更换为不含Brd U 的正常含血清培养基，显微镜下观察。

1.2.2 免疫荧光鉴定 72 h 后细胞铺满细胞爬片约80%，将细胞爬片取出。用PBS 清洗细胞爬片后，4%多聚甲醛固定爬片15 min；然后用0.5%Triton X-100 室温通透细胞爬片，用山羊血清封闭细胞爬片30 min；孵育一抗（小鼠抗大鼠α-actin 1∶100；兔抗大鼠肌钙蛋白T 1∶100），4℃孵育过夜。第二天用PBS 清洗细胞爬片，加入荧光二抗（FITC-羊抗小鼠IgG 1∶100；CoraLite594 conjugate-羊抗兔IgG 1∶100），37 ℃孵育1 h；复染细胞核，滴加DAPI 避光孵育5 min（从滴加荧光二抗开始，后续步骤均要避光操作）；最后滴加抗荧光淬灭剂，用倒置荧光显微镜观察并采集图像。

2 结果

36 h 后镜下可见细胞已经贴壁，贴壁细胞形状不一，有梭形、三角形，还有一部分形状不规则（见图1），少数细胞出现自发搏动；72 h 细胞聚合成片，细胞搏动逐渐同步。72 h 后细胞铺满细胞爬片约90%，可用于免疫荧光鉴定与HE 染色观察细胞形态（见图2）。阳性细胞（心房肌细胞）可表达α-actin蛋白与心肌肌钙蛋白T，同时用DAPI 复染细胞核，可观察阳性细胞占总细胞的百分比，结果表明心房肌细胞占总细胞数超过95%（见图3）。

图1 心房肌细胞培养36 h（×100）

图2 心房肌细胞培养72 h后HE染色（×200）

图3 培养细胞免疫荧光鉴定（×100）

目前多数文献采用“两步法”提取心肌细 胞[6-7]，使用0.25%胰酶4 ℃消化心肌组织过夜，第二天继续用胶原酶消化细胞。本研究也尝试分别使用0.25%以及0.125%胰酶消化心肌组织过夜，但是过夜时间难以控制。实验结果显示，72 h 后镜下见过夜消化的心肌细胞较使用0.25%胰酶4 ℃消化5～6 h 所获得的心肌细胞明显减少（见图4）。

图4 不同消化法消化后心房肌细胞培养72 h（×100）

3 讨论

心肌细胞的体外培养是心血管疾病研究的基本技术，市场上虽有H9C2、HL-1 出售，但是永生化细胞的某些生理特性与原代提取的心肌细胞存在差异。在研究心肌细胞的电生理、信号转导以及药物毒性等，通常需要原代培养的纯度较高、活力较好心肌细胞。本研究（两步法提取原代心肌细胞）在现有文献方法的基础上加以改进，明显提高了细胞的收获率。

本研究的创新点在于将胰酶联合胶原酶同时消化心肌组织（一步法）改为“两步法”，同时提高胰酶浓度而缩短胰酶消化时间。目前较多的文献采用“一步法”提取心肌细胞[8-10]。当使用胰酶和（或）Ⅱ型胶原酶混合同时进行消化时，消化时间难以掌握，若消化过度则容易使细胞中的DNA与胶原混合，形成黏液状物质，使含细胞的上清液难以从消化体系中分离，细胞量明显减少而影响细胞收获率。而使用“两步法”提取原代心肌细胞则可明显减少黏液状物质，当将心房组织放置于4 ℃环境中消化时，0.25%的胰酶可以缓慢消化组织，使得心房组织变得疏松，再使用Ⅱ型胶原酶消化时可以迅速消化细胞间的胶原纤维，大大提高细胞收获率。王伟等[10]采用两次差速贴壁（45 min/次）分离成纤维细胞。本研究初期使用两次差速贴壁，发现第二次差速贴壁所获得的成纤维细胞甚少，故采用90 min 差速贴壁分离成纤维细 胞[10]。一次差速贴壁联合0.1 mmol/L Brd U 可明显减少成纤维细胞的含量，较两次差速贴壁明显降低了提取成本。

本研究的另一个创新点是Ⅱ型胶原酶与BSA的联合使用，BSA 可以降低消化酶对细胞的损伤，提高细胞的活性。此外，可以先将Brd U 配制成 10 mmol/L 溶液，待差速贴壁完成后,按1 mL 含细胞培养基加10 μLBrd U，可以减少离心次数，降低细胞损伤，提高细胞活力。鉴定方面，大多数研究只采用α-actin 蛋白荧光染色鉴定[9-11]，Burstein 等[12]在实验中发现，有95%首代的成纤维细胞表达α-actin 蛋白，故本研究采用α-actin 蛋白联合心肌肌钙蛋白T 的双荧光法鉴定。

综上所述，采用“两步法”（使用0.25%胰酶4 ℃消化心房肌组织5～6 h，然后用0.1%Ⅱ型胶原酶＋0.5%BSA 消化液消化心房组织）可更有效地培养原代心房肌细胞。