线粒体自噬相关蛋白与脑缺血再灌注损伤的相关性研究进展

熊冰婕，曹飘 综述 刘安祥，张骏 审校

遵义医科大学附属医院，贵州 遵义 563000

脑卒中是我国成人致死、致残的首位病因，是严重危害中国国民健康的重大慢性非传染性疾病，其中，缺血性脑卒中占所有脑卒中的85%左右[1-2]。急性缺血性脑卒中最有效的治疗方法就是在有效的时间窗内及时开通血管，恢复缺血脑组织的血供、挽救缺血半暗带[3]。在实际临床工作中，开通血管受交通、时间窗及适用范围的影响，能进行溶栓治疗的患者数量有限，然而对于那些错过时间窗的缺血性脑卒中患者来说，仍需要规范化治疗才能提高患者生存质量[4]。此外，接受此治疗的患者还会面临脑缺血再灌注损伤的威胁，如诱发脑水肿，颅内压增高、脑疝等致命并发症[5]。因此，深入研究缺血性脑卒中溶栓后缺血再灌注损伤的相关发生发展病理机制对于缺血性脑卒中的治疗极其重要。研究表明，线粒体自噬异常所致严重的线粒体功能障碍可导致血脑屏障破坏和神经元损伤，是脑缺血再灌注损伤最基本的机制[6-7]。线粒体是存在于大多数真核细胞中的双膜细胞器，参与了细胞的能量供应和凋亡的过程，被称为细胞的“能量工厂”[8]。在机体中线粒体分裂和融合是动态平衡的[9]，线粒体自噬对于线粒体稳态和受损线粒体的清除极为重要[10]：线粒体受损时，线粒体裂变过程“切断”线粒体受损部分，形成两个线粒体，一个受损的线粒体和一个健康的线粒体，健康线粒体与其他健康线粒体融合，受损线粒体不能与其他线粒体融合且被自噬系统选择性降解，这被称为线粒体自噬[11-12]。在后生动物如黑腹果蝇、哺乳动物中，靶向受损线粒体以实现自噬涉及两个蛋白：PARK2以及编码线粒体定位激酶的假定激酶1(PTEN-induced putative kinase 1，PINK1)，其蛋白产物Parkin是细胞质E3泛素连接酶[13]。作为线粒体自噬中最主要的途径，PTEN 诱导的PINK1/Parkin介导线粒体自噬在脑缺血再灌注损伤中发挥了重要作用[14-15]。关于PINK1/Parkin 介导相关蛋白参与缺血再灌注的研究方兴未艾，现就线粒体自噬相关蛋白PINK1/Parkin 与脑缺血再灌注损伤的相关性予以综述。

1 PINK1、Parkin及其介导的线粒体自噬

PINK1 是一个含有581 个氨基酸的蛋白，具有线粒体靶向信号，这个信号是一个跨膜螺旋和结构域在N端的丝氨酸/苏氨酸激酶；Parkin 是一种与家族性帕金森病有关的细胞质E3 连接酶，在PINK1 的下游作用，Pallank 小组发现Parkin在线粒体形态学和功能的维护中起着重要作用[11]。在健康线粒体中，PINK1 被线粒体内膜菱形蛋白酶老年素相关的菱形样蛋白(presenilin-associated rhomboid-like，PARL)切割并被蛋白酶体降解[16]。在各种不利条件下，如缺氧和营养耗尽，线粒体会受损。功能失调的线粒体产生多余的活性氧(reactive oxygen species，ROS)，促进线粒体去极化[17]。线粒体损伤时，PINK1 稳定并积累在线粒体外膜上，募集、磷酸化Parkin 以诱导泛素化线粒体蛋白[18]。WEN 等[19]发现，PINK1过表达组小鼠招募磷酸化Parkin，增加线粒体自噬，降解受损线粒体，使ATP 生成增加以及ROS生成减少，从而改善线粒体功能。另有LAN 等[20]证实再灌注后24 h 线粒体达到最大自噬。因此，PINK1/Parkin 介导线粒体自噬对细胞的能量供应、凋亡有重要意义。

2 参与脑缺血再灌注损伤中线粒体自噬的相关蛋白

2.1 optiineurin (OPTN) 靶向自噬体是自噬的关键一步，选择性自噬涉及货物接头蛋白的作用，如OPTN，此蛋白通过微管相关蛋白轻链3(microtube-associated protein 1 light chain 3，LC3)相互作用区域与ATG8蛋白结合参与选择性自噬。在PINK1/Parkin介导的自噬过程中，除了从细胞质池募集ATG8家族蛋白脂化膜外，OPTN-ATG9A启动了自噬膜上泛素化产物的从头生物生成[21]。OPTN，而不是其他自噬受体，能特异性地将含ATG9A的囊泡招募到病灶，这表明OPTN与含ATG9A的囊泡形成复合物。ATG9A是核心自噬蛋白中唯一的多跨膜蛋白，存在于胞浆囊泡中，也存在于反式高尔基网络和内体膜上[22]。但PADMAN等[23]认为PINK1/Parkin自噬过程中的货物选择性是通过线粒体表面的从头自噬体生物发生实现的，而不是通过自噬膜上ATG8的桥接。OPTN蛋白与TBK1 的激活相关：线粒体去极化激活 TBK1 可促进 SQSTM1、OPTN 和NDP52 的磷酸化，且TBK1 活性是OPTN 有效募集到去极化线粒体的关键[24]。RICHTER 等[25]发现存在两种不同的TBK1 激活途径：Parkin 依赖和Parkin 独立，由于OPTN对线粒体的稳定招募也依赖于Parkin的存在，所以在Parkin 过表达时TBK1 的激活增加可能与其与OPTN 的相互作用有关。TBK1 激活线粒体去极化后，这种效应需要上游激酶PINK1 的参与，并通过Parkin的表达进一步促进。此外，TBK1的激活和线粒体定位取决于其与OPTN的相互作用以及OPTN在线粒体上与Ub结合的能力。反过来，OPTN在线粒体自噬过程中的功能依赖于其被激活的TBK1 磷酸化，这可以通过非磷酸化OPTN突变体表达后线粒体定位和自噬的减少来证明。S473 和S513 的双磷酸化在体外可激活多聚泛素ubiquitin(Ub链)结合，在体内可促进TBK1 激活、受损线粒体OPTN 保留和线粒体自噬。因此，线粒体上Ub链的合成启动了TBK1激活，TBK1介导的OPTN 磷酸化通过结合OPTN/TBK1 在泛素化线粒体上的招募和保留，形成一个信号放大环路，以促进自噬体捕获线粒体。PINK1/Parkin通过TBK1 促进 OPTN、NDP52 和 SQSTM1 磷酸化。MOORE 等[26]证明耗尽OPTN，而不是NDP52，可以阻止有效的线粒体自噬，因此OPTN是启动线粒体线粒体自噬的必需受体。

2.2 NDP52 VARGAS 等[27]证 明 NDP52/TBK1以LC3独立的方式将ULK1复合物招募到泛素化的货物中，导致ULK1 激酶激活。有报道证明，ULK1的活性对于PINK1/parkin介导的自噬是必需的。增加货物上ULK1 的局部浓度足以驱动自噬诱导，克服富营养条件下对自噬的抑制。NDP52和TBK1在货物上的定位耦合了ULK1的激活和空间调控以启动PINK1/parkin介导的自噬。

2.3 p62/Sequestosome1 (SQSTM1) SQSTM1基因编码包含多个结构域的多功能蛋白p62，该结构域以错误折叠、聚集和/或泛素化蛋白为靶点，通过自噬降解[28]。p62包含多种可识别多泛型蛋白并降解多泛型蛋白的相互作用域，调控氧化应激和自噬的发生发展，在信号传导过程中起着重要作用[29]。线粒体通过自噬受体p62/SQSTM1 和LC3的相互作用，驱动泛素化线粒体被自噬小体自噬降解[28]。IVANKOVIC 等[17]发现，p62 蛋白在线粒体自噬诱导后表达上升，而在PINK1 敲除的细胞中上升的p62 表达被阻止，结果表明p62表达的增加是对PINK1/Parkin介导线粒体自噬的响应；另一种观点认为，p62是受损线粒体聚集所必需的，而不是自噬本身[21]。因此，通过拮抗p62 的上调，可以抑制线粒体自噬的过度激活或受损线粒体的聚集，从而减轻脑缺血再灌注损伤。

2.4 动力蛋白相关蛋白1(dynamin-related protein 1，Drp1) Drp1 的募集是线粒体裂变的一个标志[30]。研究发现线粒体裂变不会促进线粒体自噬，而是通过抑制PINK1/Parkin 活性，降低线粒体氧化应激、维持正常的线粒体膜电位(MMP)以保护健康的线粒体结构域免受消除[31-32]。TANG 等[33]发现 Parkin 诱导再灌注损伤后Drp1的降解，保护再灌注诱导的细胞凋亡和线粒体功能障碍，再灌注的损伤不仅诱导线粒体碎片化，而且通过非转录机制调控Drp1 的表达。GU 等[34]发现缺乏PINK1或Parkin 的神经元积累Drp1，导致过量的线粒体裂变增加氧化应激，减少了ATP 的产生。FLIPPO等[35]对缺乏内源性Drp1抑制剂的小鼠的研究结果表明，Drp1依赖的线粒体裂变确实有助于缺血性脑卒中损伤，而靶向Drp1 调控因子或直接磷酸化Drp1 可能具有减少缺血性损伤的治疗潜力。因此，Drp1 表达的改变在脑缺血再灌注损伤中直接影响细胞代谢并最终影响细胞存活。

3 线粒体自噬相关蛋白在脑缺血再灌注损伤中可能治疗靶点及药物

3.1 氢(H2) H2是一种无色、无臭、快速扩散的医用气体，由于氢分子在哺乳动物细胞中通常被表示为惰性气体，因此以前人们认为氢分子在人体细胞中没有功能[36]。近年来氢被发现是治疗脑血管疾病的有效新颖介质，2007 年 YANG 等[37]发现，H2具有选择性的抗氧化特性，通过特异性中和羟自由基(hnyoh)和过氧亚硝酸盐(ONOO-)，保护大脑免受缺血再灌注损伤和脑卒中的影响。而后，WU等[38]用新生SD大鼠建立氧葡萄糖剥夺/再灌注(oxygen glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R)实验模型，发现OGD/R 损伤可诱导线粒体自噬相关的mRNA 和蛋白PINK1 和Parkin 的表达，H2和RAP(自噬激活剂)处理可进一步提高其表达水平，而3-MA(自噬抑制剂)抑制其表达水平，结果表明H2通过线粒体自噬和PINK1/Parkin修复了OGD/R 诱导的海马神经元损伤。此外，理论上据药物的剂量-效应关系，高浓度H2的效果应该比低浓度H2好，吸入高浓度H2应该是治疗脑血管疾病的更佳选择，夏裕宁等[39]证明高浓度H2确实对脑缺血再灌注损伤大鼠产生明确的保护作用。综上，H2可保护线粒体功能，对脑缺血再灌注损伤有良好的治疗作用。

3.2 灯盏花素 据报道，灯盏花素注射液能减少实验性大鼠缺血边缘区神经细胞凋亡数量、减缓缺血神经元损害，从而达到脑保护作用[40]。灯盏花素提取自菊科植物灯盏花，主要有效成分为灯盏乙素，化学结构为4,5,6-三羟基黄酮-7 葡萄糖醛酸苷[41-42]。WU等[43]发现，灯盏花素诱导PINK1/Parkin 介导线粒体自噬：灯盏花素可以稳定OMM(线粒体外膜)上的PINK1，然后招募和激活Parkin，调节Parkin的E3连接酶活性从而促进线粒体自噬，这有助于防止脑缺血再灌注损伤。研究结果为灯盏花素在未来抗脑缺血再灌注损伤药物开发中的潜在应用提供了有价值的信息。

3.3 电针(electroacupuncture，EA) 电针是一种结合传统针灸和电刺激的技术。电针在中国已被广泛用于治疗中风，其疗效已得到认可，可有效保护脑组织，然而，具体机制尚不清楚[44]。WANG等[45]以大鼠建立实验模型，重点研究了EA治疗对线粒体的影响，发现EA 能增强PINK1/Parkin 介导线粒体自噬清除，减少受损线粒体的积累，改善硝基/氧化应激诱导的脑缺血再灌注所致的线粒体功能损伤。研究结果为EA对缺血性卒中治疗的分子机制提供了更好的理解。

4 小结

综上，线粒体自噬相关蛋白PINK1/Parkin 参与了脑缺血再灌注损伤，在治疗方面具有重要价值，该信号通路的结构和功能及其与效应因子的关系较为复杂，因此需要进一步开展相关方面的研究。线粒体自噬是一个动态过程，调控其激活程度具有难度，且在单一静态时间点评估PINK1/Parkin 的表达可能会产生一定误差[46-47]。因此将来对PINK1/Parkin 介导线粒体自噬参与缺血性卒中的机制进一步深入的探讨，将有助于阐述急性缺血性脑卒中后脑缺血再灌注的发病机制，且为把控缺血再灌注损伤中线粒体自噬的激活程度提供指导，从而减少其带来的伤害，达到治疗目的，并为人类疾病治疗提供新的分子靶标和方向。