角膜新生血管治疗研究进展

王 舒，丁芝祥

(桂林医学院，广西 桂林 541199)

在正常生理条件下，角膜在光学上是透明的，由于炎症、创伤、营养不良或先天性异常等原因，影响角膜的透明度，从而影响视力。正常情况下，角膜在促血管生成和抗血管生成因子之间保持动态平衡，使其在正常的稳态条件下保持无血管[1]。在病理情况下，毛细血管超越角膜缘进入角膜透明区，角膜的“血管赦免”状态被打破，使角膜产生新生血管[2]。角膜新生血管(corneal neovascularization，CNV)是一种常见的病理改变，它可在角膜移植、角膜炎、佩戴角膜接触镜等不同的临床背景下发生，通过破坏角膜免疫赦免加剧炎症反应，进而损害视功能[3]。Chen等[4]的统计发现，CNV致盲率高达57.4%。因此，CNV的治疗一直受到国内外学者的关注，是一个亟待解决的难题。目前，随着大量研究的开展，CNV的治疗研究已取得很大的进展。本文主要围绕CNV的发病机制及治疗最新进展进行综述。

1 角膜新生血管的形成机制

角膜新生血管的发生是一个复杂的过程，其具体的发生机制尚不明确，目前的研究表明角膜新生血管的发生可能与炎症性疾病、角膜移植物排斥反应以及角膜接触镜相关的缺氧、碱烧伤、基质溃疡、无虹膜和角膜缘干细胞缺乏等疾病有关[1]。

1.1 角膜新生血管形成的病理生理学

角膜新生血管由纤维结缔组织网络(由纤维蛋白、纤维连接蛋白和其他结缔组织成分组成)支持。血管形成早期表现出不稳定性和渗漏性，它缺乏周细胞、平滑肌细胞、血管内皮细胞之间的紧密连接以及与细胞外基质的稳定结合，而这种紧密连接与稳定结合恰恰是成熟血管的特征。如果促血管生成因子在新生血管中不再占优势，那么正常的稳态就会得以重建，这些新生成的血管就有可能会退缩。然而，在存在慢性炎症的情况下，早期的CNV可以成为永久性的。发展中的CNV侵蚀血管生成和相对免疫原性的赦免区，加剧和扩大引发CNV的炎症。因此，即使是低水平的慢性、未查出的角膜或角膜旁炎症也可能导致严重的CNV。

1.2 角膜新生血管相关细胞因子

目前认为角膜新生血管形成的主要原因有缺氧、炎症等。缺氧使组织产生和释放大量新生血管形成因子，从而刺激 CNV 形成。炎症在新生血管的形成中起着直接或间接作用，在炎性角膜组织损伤后，多种细胞类型(包括角膜上皮细胞和内皮细胞、角膜基质细胞、免疫细胞如T细胞和巨噬细胞、血管内皮细胞)会释放大量促血管生成细胞因子[5]。

研究发现，促新生血管形成的因子很多，主要有血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、表皮生长因子(epidermal growth factor， EGF)、转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、碱性成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、基质金属蛋白酶家族(matrix metalloproteinases，MMPs)等。其中，VEGF是目前公认的在众多血管调控因子中功能最强的促血管形成因子，也是内源性角膜血管生长因子之一，是CNV形成过程中的关键血管因子[6]。

抗新生血管形成因子大多为促新生血管形成因子的拮抗剂，包括内皮抑素(endostatin)、色素上皮衍生因子(pigment epithelium derived factor， PEDF)、凝血酶敏感蛋白(thrombospondins)、组织金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitors of metalloproteinases， TIMPs)等。其中，内皮抑素是作用最强、效果最好的血管生成抑制剂，它能特异性抑制血管内皮细胞在bFGF 诱导下的增殖和迁移，促进内皮细胞凋亡。而TIMPs则是MMPs的特异性抑制剂，它以共价键的形式与MMPs结合成为复合体，从而抑制MMPs的活性。

生理情况下，正常角膜组织的促血管生成因子和抗血管生成因子之间保持动态平衡， 病理状态下，二者之间的平衡状态被打破，从而导致CNV。

1.3 角膜新生血管形成相关信号通路

角膜新生血管形成相关信号通路复杂多样，已有一些研究通过特异性调控其信号通路用于角膜新生血管的治疗，取得了一些进展。

1.3.1 VEGFR2(VEGF受体2，VEGF receptor 2)/STAT3信号通路VEGFR2(VEGF受体2，VEGF receptor 2)/STAT3信号通路是血管生成中非常重要的一个信号通路，STAT3是一种转录因子，可被多种细胞因子和生长因子激活。激活后，STAT3易位入核，调控凋亡、增殖、迁移及核内相关基因的表达[7]。在肿瘤血管内皮细胞中，VEGFR2通过上调STAT3，导致STAT3移位进入细胞核，导致肿瘤血管生成[8]。Shen等[9]通过研究发现，黄嘌呤通过下调VEGFR2的表达水平抑制STAT3的核定位和蛋白磷酸化，抑制下游PI3K/Akt信号通路的激活，从而抑制碱烧伤诱导的大鼠角膜新生血管的形成。

1.3.2 Notch信号通路 Notch信号通路是通过调控细胞增殖和分化影响细胞命运的重要信号转导通路[10]。Notch配体和受体在内皮细胞中表达，其中Notch 1受体和DLL4配体在促进血管生成中起基础性作用。葛秩睿[11]的研究表明，在碱烧伤诱导的大鼠角膜新生血管模型中，Notch1/DLL4信号通路在角膜新生血管的形成阶段高度表达，且特异性抑制DLL4后成功阻断了Notch信号在角膜新生血管中的表达。

1.3.3 p38信号通路 p38是丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)的一个亚族，因其分子量为38kd而得名，p38信号转导通路是MAPK信号系统的重要分支。p38信号通路在炎症反应中起着重要作用[12]，而炎症因素在新生血管形成中又起着重要作用。p38在许多组织中均有表达，MAPK激酶通过双重磷酸化激活p38，活化后的p38进入细胞核，激活多种蛋白激酶和转录因子产生生物学效应[13]。张海峰[14]通过角膜缝线法建立大鼠角膜新生血管模型，检测p38的表达从而证实p38信号转导通路参与调控大鼠CNV生长。

2 角膜新生血管的治疗

原则上，促血管生成因子或抗血管生成因子均可作为预防和治疗CNV的治疗靶点。目前CNV的治疗主要包括药物治疗和手术治疗，药物包括有抗VEGF药物(如雷珠单抗、康柏西普、贝伐单抗等)、类固醇激素、非甾体抗炎药、免疫抑制剂、普萘洛尔等，手术治疗主要有细针透热疗法(FND)、激光治疗、光动力疗法(PDT)、角膜缘干细胞移植等。

无血管角膜移植手术可能是治疗CNV最显著的方法，虽然原则上角膜移植可以在CNV病例中恢复一个清晰的中心视轴，但由于CNV存在的高排斥风险，以及CNV在移植物边缘迅速侵入新组织的风险，角膜移植的临床应用可能受限。在血管系统相对成熟的情况下，药物疗法可能无效，可以考虑激光物理消融术、细针透热疗法或光动力疗法(PDT)。研究发现，上述这些技术本身就是破坏性的，存在对周围角膜和角膜缘干细胞造成附带损害的风险。

与手术治疗相比，药物治疗更方便，副作用更少，更容易被患者接受。外用类固醇药物通常是局部制剂，几十年来一直是CNV治疗的中流砥柱，它通过阻止血管内皮细胞和包括巨噬细胞在内的炎症细胞的激活、迁移和招募来抑制CNV。类固醇还可能通过抑制血管平滑肌细胞VEGF的表达而具有直接的抗血管生成作用，并可能抑制VEGF信号的下游效应，目前仍是临床治疗CNV的首选药物。但由于其存在眼压升高、引发白内障等不良副作用，不宜长期服用。因此，需要探索效果更好、不良反应更少的角膜新生血管治疗方法。

2.1 基因靶向治疗

基因治疗是指利用病毒和非病毒载体将目的基因转移到细胞中，以纠正细胞功能障碍或恢复细胞功能。角膜独特的解剖位置和相对的免疫特权，使其成为基因治疗的理想组织[15]。基因疗法治疗CNV可以通过抗血管生成因子的转基因表达或通过基因沉默使促血管生成因子失活来实现[16]。腺相关病毒(adeno-associated viral， AAV)载体介导具有抗血管生成作用的基因，如内皮抑制素和血管抑制素，转染角膜上皮细胞，在兔角膜新生血管模型中成功降低了CNV的发生及生长。Chen等[17]的研究表明，通过结膜下注射重组逆转录病毒载体介导的mEndo和msFlk-1基因能有效抑制小鼠碱烧伤引起的角膜新生血管。Liu等[18]发现，与对照组相比，基质内传递针对人类VEGF基因唯一相同序列的siRNA可抑制55.7%角膜中VEGF的表达，69.5%白细胞浸润以及CNV形成。Han等[19]进一步证明了以可还原支化聚乙烯亚胺(rBPEI)为基础的纳米颗粒系统作为一种新的siRNA载体有望用于治疗CNV。尽管大量的研究表明基因治疗能有效治疗角膜新生血管，但其尚存在安全性、可控性、复杂性、低效及伦理等问题。

2.2 热敏水凝胶治疗

在过去的几十年里，各种聚合物载体被广泛用于持续和控制药物的递送。接触镜、植入物、聚合物纳米颗粒、脂质体、树状大分子和水凝胶在眼部用药方式引起了广泛关注。Xu等[20]的研究结果表明，Ava-PECE(avastin-poly-ethyleneglycol-poly-ɛ-caprolactone-poly-ethyleneglycol)水凝胶的应用可明显降低缝线诱导的兔角膜新生血管的生长。因此，Ava-PECE水凝胶作为一个持续的药物传递系统可能是一个有前途的治疗角膜新生血管的载体。Liu等[21]的研究中，以聚D， l -乳酸-乙醇酸-聚乙二醇-聚D， l -乳酸-乙醇酸(PLGA-PEG-PLGA)共聚物为药物传递载体，分别在体外和体内证明了可生物降解的热敏水凝胶联合二甲双胍(metformin，MET)和盐酸左氧氟沙星(levofloxacin hydrochloride， LFH)治疗可以增强CNV的抑制作用。由以上研究可知，热敏水凝胶是一种随着温度变化而发生可逆溶胶-凝胶转变的新型水凝胶，提供了一种局部、高效的用药方式，且毒性低、生物相容性好，有很大潜力加速治疗眼部新生血管形成，但目前尚未应用于临床。

2.3 血管生成抑制剂—富马西林

富马西林是由烟曲霉产生的一种自然分泌的水溶性抗生素，可有效抑制包括溶组织内阿米巴在内的肠原生动物[22]。富马西林也被证明可以抑制被烟曲霉污染的培养物中的内皮细胞增殖，并被鉴定为血管生成抑制剂[23]。在Emoto等人[24]的体外研究中被证实富马西林可以抑制子宫癌细胞中VEGF的表达。其中有一项关于CNV的研究强调了TNP-470(一种合成的富马西林类似物)可以抑制C57BL6小鼠的炎性角膜血管生成。虽然目前有许多研究表明富马西林在抑制新生血管生成方面有一定疗效，但是由于其毒性特征，在人体内疗效仍存在争议。

2.4 酪氨酸激酶抑制剂—阿西替尼

阿西替尼是一种有效的合成分子，它可以稳定非活性构象中的激酶结构域，从而阻断VEGF信号转导通路[25]。阿西替尼是一种来自吲唑(mw 386.47 Da)的强效小酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitors，TKI)，已被证明在多种肿瘤中具有优势，包括黑素瘤、结直肠癌、胰腺、甲状腺、乳腺和肺肿瘤。在皮摩尔浓度下，它是VEGF酪氨酸激酶受体(VEGFR-1、VEGFR-2和VEGFR-3)的一种有效和高度选择性抑制剂。在纳摩尔浓度下，它还能抑制血小板衍生的生长因子受体(抑制PDGF-α和PDGF-β)。Lledo等[26]通过观察不同浓度的阿西替尼治疗角膜新生血管的疗效发现，阿西替尼的作用是通过与VEGF受体的激酶结构域结合，使其稳定在非活性构象中，从而抑制VEGF信号转导。阿西替尼已被证实可以抑制新生血管，但其作用机制、最佳剂量和不良反应等问题有待进一步研究。

2.5 腺苷酸活化蛋白激酶激活剂—二甲双胍

二甲双胍是糖尿病一线降糖药物，近来发现其在抑制肿瘤细胞增殖和新生血管形成方面均有很好的药理作用。朱丽华等[27]通过动物实验研究证实二甲双胍能抑制碱烧伤诱导的大鼠角膜新生血管的生成，其主要与二甲双胍降低促血管生成因子表达量和增加抑血管生成因子表达量有关。Garrido等[28]的研究中，二甲双胍在细胞系中抑制了神经生长因子诱导的增殖和促血管生成作用。Han等[29]的研究证明二甲双胍可以直接抑制人视网膜血管内皮细胞(human retinal vascular endothelial cells，hRVECs)的血管生成，并阻止TNF诱导的hRVECs中多种炎性细胞因子表达的上调。综合各种研究结果，二甲双胍有望成为治疗角膜新生血管的新药物。

3 总结与展望

综上所述，CNV的形成是由多种因素共同作用的结果，目前临床上大部分药物仍处于实验研究阶段，对其安全用量、不良反应、临床应用机制等方面还需进一步研究。随着对CNV形成机制认识的深入，CNV的治疗将不断完善，未来将开发多种机制药物的联合应用，探索更为安全、有效、不良反应低的治疗方法。