中西药联合应用对铜绿假单胞菌抗菌作用的研究进展①

(桂林医学院第二附属医院中心实验室，广西 桂林 541199)

铜绿假单胞菌是一种常见的院内感染条件致病菌。近年来，由于抗生素的不规范使用等原因，造成铜绿假单胞菌的耐药现象越来越严重，多重耐药和泛耐药菌株的不断出现，给临床治疗工作带来了极大的困难。

我国中草药资源丰富，使用历史悠久，具有相对可靠的使用安全性。由于清热解毒类中草药成分特殊、复杂，抗菌作用和机制原理不单一，所以很少发现其耐药性，但存在抑菌作用有限、抑菌效果不稳定、抑菌机制不清楚等问题。中西药的使用各有优缺点，而中西药物合用则可以优势互补，所以中草药和抗生素的联合应用具有广阔的研究空间和开发前景。

1 铜绿假单胞菌的耐药机制

1.1 基因突变改变通道蛋白和外膜通透性

Pa菌株细胞膜上的通道蛋白相对较少，孔径狭窄，通透性差，多数抗菌物质难以进入菌体，使其天然对多种抗生素耐药。oprD2 是细胞膜上容许亚胺培南通过的通道蛋白。oprD2 编码基因的缺失突变，改变通道蛋白结构，使 Pa 对亚胺培南耐药[1]。

1.2 菌株酶类改变抗生素活性结构

耐药Pa菌株能通过编码多种水解酶类和修饰性酶类而破坏或修改抗生素的活性结构，从而实现耐药。相关酶类的编码基因可由 Pa基因组携带，也可通过质粒或整合子获得。耐药 Pa 菌株通过编码多种β-内酰胺酶基因而对多种β-内酰胺类抗生素耐药，当前被编码的β-内酰胺酶类基因主要有以下几种。①头孢菌素酶(AmpC)基因：位于所有的 Pa 菌株染色体上，低水平表达，在β-内酰胺类抗生素的诱导下，表达水平激增[2]；其他多种类型的 AmpC 酶也可由质粒编码，实现对大多数β-内酰胺类抗生素的天然耐药[3]。②超广谱β-内酰胺酶(extend-spectrum β-lactamases， ESBLs)基因：部分耐药Pa 菌株可由基因组编码，也可由质粒编码，水解青霉素类、窄谱和超广谱头孢菌素[4]。③金属β-内酰胺酶基因(metallo-β-lactamases， MBL)：MBL依赖金属离子发挥活性，编码基因可由耐药菌株染色体携带，也可由质粒、转座子和整合子携带，可对碳青霉烯类抗生素、大部分β-内酰胺类抗生素和β-内酰胺酶抑制剂类抗生素耐药。MBL 类型多样，是多重耐药耐药 Pa 菌株出现的原因之一[5-6]。耐药Pa菌株编码的修饰性酶类主要是氨基糖苷类修饰酶，耐药Pa菌株通过编码氨基糖苷乙酰转移酶(aminoglycoside acetyltransferase， AAC)、氨基糖苷磷酸转移酶(aminoglycoside phosphate transferase， APH)和氨基糖苷核苷转移酶(aminoglycoside nucleoside transferase， ANT)对进入菌内的氨基糖苷类抗生素进行修饰，使其失活。AME(aminoglycoside modifying enzymes， AME)编码基因广泛存在于质粒、转座子和整合子都元件中，可在细菌种内和种间传播[7]。

1.3 基因突变或编码酶类改变药物作用靶位

细菌细胞膜上的青霉素结合蛋白(penicillin binding protein， PBPs)参与细胞壁肽聚糖的合成，也是β-内酰胺类抗生素的作用靶位。β-内酰胺类抗生素与 PBP 结合，使细胞壁合成受阻，进而使细菌死亡。Pa菌株的 PBP 基因发生基因突变，改变 PBP 蛋白结构，降低或消除其与β-内酰胺类抗生素的亲和力，使其对该类抗生素耐药。拓扑异构酶的相关基因突变也可以改变拓扑异构酶结构，使 Pa 菌株对喹诺酮类抗生素耐药[8-9]。

1.4 过度表达外排泵相关基因

外排泵是位于Pa菌株细胞膜上的质子泵，能够选择性地把进入菌体内部的抗生素排出。一个外排泵一般由3种蛋白质组成。①膜外通道蛋白：形成通道门，用于排出药物。②通道蛋白：连接膜内、外蛋白，形成通道。③膜内蛋白：识别药物，并把它转运出菌体。这3种蛋白质共同作用发挥外排作用。目前已经发现 13 种外排系统，不同的外排的外排泵系统，识别和外排的抗生素底物有一定的特异性[10-12]。

1.5 形成生物被膜

生物被膜(biofilm)是细菌及其分泌的胞外多糖和胞外蛋白组成的混合物，使其覆盖在物体或机体腔道表面，形成膜状结构。生物膜是细菌耐药的机制复杂。生物膜里的藻酸盐多糖能够抵御抗菌药物的渗透，使抗菌药物难以接触菌体。生物膜含有的多种酶类也能够使多种抗生素失活，使 Pa菌株对相应抗生素耐药[13]。

1.6 整合子

整合子是一种类似于质粒、转座子的可移动遗传单位。在Pa菌株耐药基因的获得和转移中发挥重要作用。同质粒不同，整合子能通过携带的位点特异性重组系统，使整合酶从周围环境中捕获耐药基因盒，并把它们组装在一起，形成巨大的耐药基因多基因座，使细菌具有多重耐药性，并在细菌种内和种间传播、扩散[14]。

2 中草药对铜绿假单胞菌的抑制作用

抗生素大量使用之前，中草药资源，特别是清热解毒类中草药在抗感染治疗中曾发挥重要作用。耐药菌大量出现，抗生素不断面临新挑战，提醒科研人员使用现代科学方法筛选、 验证传统药用植物的抗菌效果，尝试寻找新型抗生素。临床感染中，革兰阳性的金黄色葡萄球菌和革兰阴性的大肠埃希菌最为常见，铜绿假单胞菌耐药现象普遍。在药用植物抑菌作用的筛选和验证中，它们是最常用的实验对象。

综合前人研究[15-22]，在传统药用植物中，至少在黄连、黄芩、黄柏、夏枯草、连翘、金银花、大黄、苦参、虎杖和薄荷等 50 多种中药中发现对铜绿假单胞菌的抑菌作用。虽然很多中草药对铜绿假单胞菌有抑菌作用，但中草药对铜绿假单胞菌的抑制作用还存在很多缺陷，主要表现在以下两个方面。

(1)中草药成分复杂，抗菌机制不单一。研究中，一种药材抑菌作用的有无对研究人员的实验方法和使用菌株有明显的依赖性。①实验方法依赖性：药材有效成分的萃取，通常有水煎法和醇提法，研究中出现水煎法提取物有效、醇提法提取物有效、水煎法和醇提法的提取物均有效、两种方法的提取物均无效等4 种情况。乙醇提取法中，不同的乙醇浓度也会影响提取物的有效性，K-B法或和稀释法的实验结果会出现不一致。②实验菌株的依赖性：在不同的研究中，当实验菌株较少时，同种药材用同种方法萃取有效成分，在不同的实验中，有效性截然不同。当实验菌株数量较多时，抑菌效果从完全无效到效果明显，效果跨度很大。以上现象都显示对不同的实验菌株，某一药材的具体有效成分和作用靶点及作用机制可能不尽相同，这可能是造成抑菌效果不稳定，抑菌机制不清楚的原因。

(2)中草药有效成分含量低，血药浓度难以达到。同现有抗生素相比，有效成分的有效性往往偏低，这造成抑菌效果相对有限。根据有效抑菌浓度，结合人体体液含量和提取方法浓缩比例，推算达到有效血药浓度时，所需的中药原药量往往较大，在临床上难以实现[15]。

3 中药和抗生素的联合应用对铜绿假单胞菌的抗菌作用

铜绿假单胞菌的耐药现象愈发严重以及中草药抗菌效果相对有限等问题促使人们考虑二者的联合使用，以达到优势互补作用。徐海瑛等[23]发现双黄连口服液联用庆大霉素对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌药敏结果均呈相加作用；王淋荆等[24]的研究发现黄芩、金银花和夏枯草可以通过促进外排泵基因表达而使环丙沙星对铜绿假单胞菌有拮抗作用，穿心莲和五倍子也能促使庆大霉素对铜绿假单胞菌表现出拮抗作用；胡芳等[25]将双黄连粉针与青霉素等多种抗生素联用作用于非耐药菌，使双黄连对细菌的MIC 下降了。抗生素的 MIC 下降，说明中西药联合应用对铜绿假单胞菌有明显的协同抑菌作用。

由于细菌基因型和中药成分的多样性，使得中草药和抗生素的联合应用效果在不同的细菌感染中，甚至在同种细菌不同菌株的感染中呈现的相互作用类型也不一致。中草药和抗生素的联用机制尚需很多更深层次的研究，而寻找能对细菌共有靶点起拮抗作用的有效成分非常必要，是保证中草药抑菌效果稳定性的基础。

中药和抗生素的协同抑菌作用，以及耐药菌株经中药处理后能恢复对相应抗生素的敏感性，表明中药在某种程度上具有逆转耐药菌抗性的能力。其逆转细菌耐药性机制有以下几点。①消除耐药质粒：耐药质粒通常携带多种耐药基因，赋予了细菌多重耐药性，可以在细菌种内和种间穿梭，也可以被物理方法、化学试剂生物学手段从细菌内部清除。据研究，黄连、白花丹、白头翁、黄芩、金银花、大黄、马齿苋、车前子、黄白等都有不同程度的质粒消除作用[26-27]。②抑制耐药相关基因表达：蒋文捷等研究证明，黄芩提取物可以降低 16SrRNA 甲基化酶 mRNA 转录，提高耐药菌对抗菌药物的敏感性[28]；穿心莲内酯对 PA 外排泵 MexAB-OprM 转录表达具有抑制作用， 可扭转 PA 的部分耐药性[29]。③降低耐药相关酶活性：高洁等研究发现芪归银方能减慢β-内酰胺酶水解速率，提示芪归银方可能是通过抑制铜绿假单胞菌的β-内酰胺酶的水解活性实现逆转其对亚胺培南的耐药性，双黄连注射液在体外对β-内酰胺酶存在抑制作用[30]。这显示中草药可能通过抑制相关酶活性在一定程度非彻底地实现耐药性逆转。④抑制生物膜合成：董必英等发现黄芩苷能破坏铜绿假单胞菌已形成的生物膜，与头孢哌酮-舒巴坦钠联用时能显著増强其对铜绿假单胞菌生物被膜的杀菌作用[31]。

4 结语

由于抗生素的滥用，使得细菌的耐药现象越来越严重，特别是耐碳青霉烯铜绿假单胞菌的耐药性现已成为临床上亟需解决的难题，它常导致临床治疗困难。当前中草药的药用价值是亟待深入研究和开发的宝贵资源。不少种类的中草药，特别是清热解毒类中药在临床具有明显的抗炎和清热解毒效果，应列为优先研究和开发对象。 黄芩、双黄连不但对铜绿假单胞菌有抑菌作用，对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌都有一定的抑菌作用。黄芩、双黄连与头孢哌酮-舒巴坦钠联用对铜绿假单胞菌的抑菌效果目前尚未见报道，本研究拟将黄芩、双黄连与头孢哌酮-舒巴坦钠等药物联用将为临床治疗耐药菌和开发新的抗耐药菌药物提供实验参考，同时为临床治疗铜绿假单胞菌引起的感染提供实验证据，具有一定的理论指导意义和临床应用价值。